向文娟，王吉祥，馮雷，馬雪濤，珠娜

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院國(guó)家熱帶農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，云南昆明650223）

丙酸鈣是世界衛(wèi)生組織（WHO）和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）批準(zhǔn)使用的安全可靠的食品與飼料用防霉劑；雙乙酸鈉是一種多功能的食用化學(xué)品，主要用作食品和飼料工業(yè)的防腐劑、防霉劑、螯合劑、調(diào)味劑、pH調(diào)節(jié)劑、肉制品保存劑，也是復(fù)合型防霉劑的主要原料?，F(xiàn)代食品工業(yè)中，常常在面包和豆制品以及糕點(diǎn)中添加丙酸鈣（鈉）和雙乙酸鈉作為防腐劑，可以有效地抑制霉菌、黃曲霉毒素的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。但是過量的食用會(huì)導(dǎo)致腸胃燒傷[1]，造成中毒甚至死亡，對(duì)兒童、孕婦等特殊人群危害更大[2]。我國(guó)衛(wèi)生部在GB 2760－2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定丙酸鈣（鈉）可以在面包、糕點(diǎn)、醬油等食品中作為添加劑使用，最大使用量為2.5 g/kg，雙乙酸鈉的最大使用量是4.0 g/kg[3]。

在對(duì)食品中丙酸鈣（鈉）和雙乙酸鈉的檢測(cè)方法上，我國(guó)制定了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，主要是蒸餾法和直接浸提法[4－5]，但蒸餾法由于檢測(cè)靈敏度和回收率都較低，樣品處理復(fù)雜，效率低，不易大批量的處理樣品；而采用直接浸提法大部分食品的水提取物成分復(fù)雜干擾嚴(yán)重，在色譜分析過程中造成基線抬升，靈敏度下降，且頻繁出現(xiàn)鬼峰，嚴(yán)重影響分析結(jié)果。采用固相萃取作為樣品前處理方法具有高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確定量、實(shí)現(xiàn)快速和自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，可以有效降低復(fù)雜樣品中的基質(zhì)干擾，提高樣品測(cè)定準(zhǔn)確度和靈敏度[6－7]。本文通過研究，對(duì)不同固相萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立Cleanert SAX強(qiáng)陰離子交換固相萃取的前處理方法，并采用Gilson公司的全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，極大的提高工作效率和實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性，從而在利用高效液相色譜進(jìn)行分析時(shí)有效降低基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津高效液相色譜系統(tǒng)（HPLC儀）：低壓梯度泵（LC－20AT）、在線真空脫氣機(jī)（DGU－20A5）、紫外檢測(cè)器（SPD－20A）、自動(dòng)進(jìn)樣器（SIL－20A）、柱溫箱（CTO－20A）和島津液相色譜工作站（Lab solution）。Milli－Q 純水系統(tǒng)：美國(guó)M illipore公司；GX－274 ASPECTM吉爾森固相萃取儀：美國(guó)Gilson。

1.2 試劑與材料

磷酸氫二銨：AR級(jí)，中國(guó)成都化學(xué)試劑廠；丙酸鈣、雙乙酸鈉：德國(guó)SAFC公司；實(shí)驗(yàn)室用超純水（18.2 MΩ）均來自Milli－Q純水系統(tǒng)；Cleanert SAX強(qiáng)陰離子交換固相萃取小柱：500 mg/6 mL美國(guó)Agela公司。

丙酸鈣（以丙酸計(jì)）、雙乙酸鈉（以雙乙酸鈉計(jì)）混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制（10.0 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取1.26g丙酸鈣（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中（相當(dāng)于10.0 mg/mL丙酸），準(zhǔn)確稱取1.00 g雙乙酸鈉（精確至0.000 1 g），用水溶解并定容至刻度。

流動(dòng)相（1.5 g/L的磷酸氫二銨溶液）：稱取磷酸氫二銨1.5 g，加水溶解并定容至1 000 mL，用1 mol/L的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.0～3.5，過0.45 μm濾膜。

1.3 樣品前處理方法

稱取5.000 g（精確至0.001 g）的樣品至25 mL比色管中，用超純水定容至刻度，浸泡過夜（或超聲提取1 h）后，濾出液體，用5%的氨水調(diào)pH至堿性，待過吉爾森全自動(dòng)固相萃取儀。

固相萃取條件：先將Cleanert SAX強(qiáng)陰離子交換柱依次用5 mL甲醇、水活化后，取上述樣品提取液1 mL，以2 mL純水淋洗，棄去淋洗液，用2 mL洗脫液進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，過0.45 μm濾膜，供HPLC分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Prevail Carbohydrate ES 5u（250 mm×4.6 mm id.）；柱溫：35 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 214 nm；流動(dòng)相：1.5 g/L 的磷酸氫二銨溶液（pH3.0～3.5）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積 5.0 μL。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別準(zhǔn)確吸取 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1.2）于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度分別為 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 固相萃取柱的選擇

因丙酸鈣（鈉）及雙乙酸鈉在酸性溶液中解離為丙酸和乙酸，均為弱酸，因此分別使用Waters Oasis MAX混合離子固相萃取柱、Cleanert SAX強(qiáng)陰離子固相萃取柱和C18固相萃取柱對(duì)同一樣品中的丙酸和雙乙酸鈉回收率作比較，結(jié)果見表1。

表1 不同固相萃取小柱對(duì)樣品中丙酸和雙乙酸鈉回收率比較Table 1 The comparison of recoveries by different SPE column%

結(jié)果表明在相同條件下，Cleanert SAX固相萃取小柱的回收率最高，可達(dá)90%以上，說明強(qiáng)陰離子固相萃取柱對(duì)于弱酸性物質(zhì)的凈化效果最好。

2.1.2 洗脫液的濃度與體積的確定

本實(shí)驗(yàn)前期分別用同濃度的磷酸溶液和鹽酸溶液進(jìn)行洗脫對(duì)比，發(fā)現(xiàn)鹽酸的洗脫效率明顯高于磷酸溶液。后分別用6%、8%、10%的鹽酸作為洗脫液，洗脫體積分別為1.0、2.0 mL時(shí)的回收率見表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用2.0 mL 10%的鹽酸洗脫回收率最高，洗脫時(shí)，洗脫速度保留在1 mL/min。

表2 不同濃度洗脫液及洗脫體積的回收率比較Table 2 The comparison of recoveries of different elution liquid and elution volume

2.1.3 方法的精密度和檢出限

在空白樣品中添加丙酸及雙乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加水平為2.0 g/kg，經(jīng)Cleanert SAX固相萃取柱凈化，用2 mL 10%HCl洗脫過濾膜后經(jīng)HPLC分析，做5個(gè)平行樣，記錄峰面積及保留時(shí)間。根據(jù)5次測(cè)定結(jié)果的峰面積計(jì)算出雙乙酸鈉和丙酸的含量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表3。保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05%。以3倍的信噪比計(jì)算檢出限，最低檢出限濃度可達(dá)0.03 mg/kg。由表3可以看出，雙乙酸鈉含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.47%，丙酸含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%（n=5）。

表3 試樣測(cè)定的精密度及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 3 The resluts of precision and recoveries in detection of sample（n=5）

2.2 與國(guó)標(biāo)直接浸提法的比較研究

將同一樣品經(jīng)加標(biāo)后，分別直接用水浸提和浸提后過Cleanert SAX固相萃取柱（以下稱過柱法），上液相色譜儀得出色譜圖，見圖1。其中虛線為直接浸提法得出的圖譜，實(shí)線為過柱法得出的圖譜。

由圖1可以看出，直接浸提法后的色譜峰出現(xiàn)鬼峰，且雜質(zhì)干擾較多。而過柱后的色譜峰峰形較好，基質(zhì)干擾較少。

2.3 與國(guó)標(biāo)蒸餾法的比較研究

將同一樣品經(jīng)加標(biāo)后，分別用國(guó)標(biāo)蒸餾法和浸提后過Cleanert SAX固相萃取柱的方法，得出溶液上液相色譜儀得出色譜圖，見圖2。其中虛線為國(guó)標(biāo)蒸餾法得出的圖譜，實(shí)線為過柱法得出的圖譜。

圖2 過柱法與蒸餾法的比較色譜圖Fig.2 Chromatogram of compared with SPE and distillated

由圖2可以看出，蒸餾法得出的色譜圖較為干凈，雜質(zhì)干擾也少，但是與過柱法比較，則回收率明顯較低，且檢出限較高，檢測(cè)結(jié)果不如過柱法的精確度高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Cleanert SAX固相萃取柱對(duì)食品樣品進(jìn)行凈化處理后經(jīng)HPLC測(cè)定食品中的丙酸鈣（鈉）和雙乙酸鈉，回收率在90%以上，最低檢出限可達(dá)0.03 mg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。而國(guó)標(biāo)蒸餾法的回收率最高只能達(dá)到70%左右，丙酸鈣（鈉）的檢出限為0.03 g/kg，雙乙酸鈉的檢出限為0.015 g/kg，同時(shí)減少了國(guó)標(biāo)蒸餾法中搭建蒸餾裝置繁瑣的程序，降低了實(shí)驗(yàn)室使用明火的風(fēng)險(xiǎn)，提高了方法的回收率和靈敏度。利用Cleanert SAX強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱，對(duì)丙酸和乙酸等弱酸有較好的凈化提取效果。有效地去除了國(guó)標(biāo)法中直接浸提后雜質(zhì)的干擾，加上利用Gilson全自動(dòng)固相萃取儀，不僅方便，快捷，而且方法的精密度和準(zhǔn)確度相對(duì)于國(guó)標(biāo)法都大大提高，同時(shí)提高了方法的重現(xiàn)性和工作效率。

[1] 趙天華.化學(xué)試劑化學(xué)藥品手冊(cè)[M].2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2006：223

[2] 王娟,高秋菊,修麗華,等.離子色譜法對(duì)食品種丙酸鈣的測(cè)定[C].杭州:第十一屆全國(guó)色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)論文集,2006:134-136

[3]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 2760-2011食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011：7-8

[4]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 23382-2009食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測(cè)定高效液相色譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009:1-3

[5]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 23383-2009食品中雙乙酸鈉的測(cè)定高效液相色譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009：1-3

[6] 張穎.生物樣品預(yù)處理技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展[J].天津藥學(xué),2006,18(1):56-58

[7] 李小平,姚潯平,陳曉紅,等.有機(jī)酸檢測(cè)的固相萃取方法研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,19(8):115-118