趙鑫，鞠世穎，周穎，劉濱，梁宏彰，高曉峰，鄭遂，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）已被全世界公認(rèn)為食品加工過(guò)程中衛(wèi)生條件較差和引起食品腐敗的主要原因[1]。葡萄球菌引起的食物中毒是由于攝入的食物中污染了耐熱的金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）[2]，腸毒素僅在金黃色葡萄球菌達(dá)到105cfu/g的情況下才會(huì)產(chǎn)生[3]，如果食品在儲(chǔ)備期間周圍環(huán)境適合金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)（例如時(shí)間和溫度）時(shí)，腸毒素將產(chǎn)生，并且給消費(fèi)者帶來(lái)潛在的危害[4－5]。金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)溫度范圍廣泛，在7℃～48.5℃都可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)條件為30℃～37℃[6]，pH 4.0～10.0，耐鹽濃度可達(dá)25%，這些特性使得金黃色葡萄球菌有廣泛的生存空間，即使在較為惡劣的條件下也能存活很長(zhǎng)時(shí)間。

在眾多S型曲線函數(shù)中，Logistic方程和Gompertz方程能有效描述微生物生長(zhǎng)，在腐敗細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究中被廣泛使用[7－8]。近年來(lái)，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artifi－cial Neural Network，ANN）逐漸被應(yīng)用于科學(xué)研究，不同于其他非線性函數(shù)，ANN通過(guò)反復(fù)將輸入輸出模式提交給網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)節(jié)高度非線性的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以便直接探索輸入輸出模式之間的關(guān)系[9]。

Matlab已被用于工程和科學(xué)研究中的諸多領(lǐng)域，它是一款在不同領(lǐng)域擁有多種專業(yè)工具箱的強(qiáng)大數(shù)學(xué)工具[10]，Matlab提供了一個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和電腦相連接的平臺(tái)，取代了復(fù)雜的專業(yè)算法，Matlab的一些基礎(chǔ)函數(shù)可被研究人員用于建立自己的Matlab工具箱，進(jìn)而分析所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本文利用Matlab編寫(xiě)程序，結(jié)合三種數(shù)學(xué)模型對(duì)金黃色葡萄球菌在12、25、37℃下的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，并進(jìn)行模型評(píng)價(jià)和分析，為原料乳的生產(chǎn)、運(yùn)輸及儲(chǔ)藏過(guò)程中的金黃色葡萄球菌控制及檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳：市售。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 25923）：乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自存；3M快速金黃色葡萄球菌測(cè)試片：美國(guó)3M公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPS-160生化培養(yǎng)箱：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌在原料乳中的培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

參照GB4789.10-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》第三法，利用3M金黃色葡萄球菌測(cè)試片，對(duì)金黃色葡萄球菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，按照菌落計(jì)數(shù)結(jié)果取一定量菌液接種于符合要求的金黃色葡萄球菌陰性的巴氏滅菌乳中，取一定量的菌液離心盡量吸取上清液，用巴氏滅菌乳稀釋，使接種終濃度在102CFU/mL～103CFU/mL范圍內(nèi)。將接種后的滅菌乳充分混勻后，以10 mL分裝于6個(gè)中試管中，兩管一組，然后分別置于12、25、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在12℃的情況下培養(yǎng)56 h，每4小時(shí)取1 mL樣品，25℃培養(yǎng)28 h，每2小時(shí)取1 mL樣品，37℃培養(yǎng)16 h，每1小時(shí)取1 mL樣品，每次計(jì)數(shù)用生理鹽水做3個(gè)倍數(shù)稀釋，取1 mL添加到金黃色葡萄球菌測(cè)試片上。每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行。然后將3M快速金黃色葡萄球菌測(cè)試片放于37℃條件下培養(yǎng)，（24±2）h后計(jì)數(shù)。

1.3.2 原料乳中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)模型的建立

分別以時(shí)間 t和 ln（N(t)/N0）為橫、縱坐標(biāo)，N0為初始菌數(shù)（CFU/mL），N(t)為 t時(shí)刻的細(xì)菌數(shù)，利用 Matlab分析不同溫度條件下原料乳中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，并根據(jù)對(duì)函數(shù)式的推導(dǎo)，求解描述微生物生長(zhǎng)曲線特性的 3 個(gè)參數(shù)（μm，λ，A）：最大比生長(zhǎng)速率 μm（h-1）指對(duì)數(shù)期中拐點(diǎn)處的正切值，微生物生長(zhǎng)的延滯期λ（h）是指該拐點(diǎn)處的切線與x軸的交點(diǎn)值，A=ln（Nmax/N0），Nmax是指穩(wěn)定期微生物數(shù)量（cfu/mL）[11]，模型函數(shù)及三個(gè)參數(shù)推導(dǎo)見(jiàn)表1。

表1 模型的函數(shù)式及參數(shù)Table 1 Functional equations and their parameters

以時(shí)間t為輸入，ln（N(t)/N0）為輸出，建立兩層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，第一層傳遞函數(shù)設(shè)置為tansig，第二層傳遞函數(shù)為purelin，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練函數(shù)為trainlm，其他均為默認(rèn)缺省值，由于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與非線性回歸模型不同，不具有一定的函數(shù)表達(dá)式，無(wú)法求得（μm，λ，A）3 個(gè)參數(shù)，只能直觀的從圖像中表現(xiàn)出細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.3.3 模型評(píng)價(jià)

模型建立完成后，需要將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，以驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和可行性，通常采用的評(píng)價(jià)方法及函數(shù)的意義如表2[12-21]。

表2 評(píng)價(jià)方法及意義Table 2 Evaluations method and their significance

1.3.4 基于Matlab2012a的3種模型程序代碼

1.3.4.1 Logistic和Gompertz模型

1.3.4.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)程序代碼

利用本程序可直接從Excel中提取數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將數(shù)據(jù)按時(shí)間為第一列，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為第二列存儲(chǔ)在文件名為“zx.xls”的Excel文件中，便于操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度下金黃色葡萄球菌在原料乳中的一級(jí)生長(zhǎng)模型

圖1 原料乳中金黃色葡萄球菌的擬合曲線（37℃）Fig.1 Growth curves of Staphylococcus aureus in raw milk（37℃）

圖2 原料乳中金黃色葡萄球菌的擬合曲線（25℃）Fig.2 Growth curves of Staphylococcus aureus in raw milk（25 ℃）

圖3 原料乳中金黃色葡萄球菌的擬合曲線（12℃）Fig.3 Growth curves of Staphylococcus aureus in raw milk（12℃）

從圖1～圖3中可以直觀的發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在37℃的條件下生長(zhǎng)較為迅速在14 h后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，而在25℃，即室溫條件下在20 h后趨于穩(wěn)定，在12℃的情況下生長(zhǎng)頗為緩慢，需36 h才能達(dá)到最大生長(zhǎng)量。并且在12℃～37℃溫度范圍內(nèi)最大生長(zhǎng)量隨著溫度的增加而增加。根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，在12、25、37℃條件下的Logistic模型穩(wěn)定期時(shí)微生物數(shù)量A 分別為 1.9236、5.5581、7.9608；Gompertz模型穩(wěn)定期時(shí)微生物數(shù)量 A分別為 1.9403、5.6158、8.1765。Logistic與Gompertz模型的函數(shù)式及微生物的最大比生長(zhǎng)速率、延滯期時(shí)間見(jiàn)表3、4。

表3 Logistic模型及參數(shù)Table 3 Functional equation of Logistic and its parameters

表4 Gompertz模型及參數(shù)Table 4 Functional equation of Gompertz and its parameters

從表 3、4 中可以看出最大比生長(zhǎng)速率 μm（h－1）隨著培養(yǎng)溫度的升高逐漸變大，但延滯期時(shí)間并沒(méi)有特定規(guī)律，這是因?yàn)榫旱幕罨瘯r(shí)間不同所引起的，菌液的活化時(shí)間直接影響了菌液的生長(zhǎng)活性，因此本文只采用最大比生長(zhǎng)速率μm（h－1）建立二級(jí)模型。

表5為通過(guò)程序計(jì)算出的10種常用的針對(duì)函數(shù)擬合的評(píng)價(jià)函數(shù)值，本文以修正決定系數(shù)R2Adj，均方誤差MSE，預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差SEP為主對(duì)三種模型進(jìn)行了對(duì)比（表5中斜體），其余7種可適當(dāng)參考，針對(duì)不同需求選取不同的評(píng)價(jià)函數(shù)。修正決定系數(shù)R2Adj，對(duì)R2的進(jìn)一步修正，避免了由于樣本大小和變量參數(shù)數(shù)目對(duì)擬合度的影響[14]，R2Adj的值越接近于1，預(yù)測(cè)模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合度越高，從表5中R2Adj的值可以看出在12 ℃條件下，擬合度 Gompertz＞ANN＞Logistic，而在 25、37℃的條件下，ANN＞Gompertz＞Logistic，ANN 模型的R2Adj值為1，可見(jiàn)ANN在擬合函數(shù)方面的優(yōu)越性；均方誤差MSE，適用于評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型的優(yōu)劣和數(shù)據(jù)的變化程度，MSE的值越小，說(shuō)明模型的精確度越好[16]，根據(jù)表5數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)在12℃的條件下Gompertz的精確度優(yōu)于ANN，而在25、37℃這兩個(gè)溫度下精確度ANN＞Gompertz＞Logistic；預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差 SEP 是指預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值差異的標(biāo)準(zhǔn)偏差，可以用來(lái)衡量和驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確度，SEP的值越小，說(shuō)明模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的描述性越好，比較表5的數(shù)值可以看出，在12℃的條件下Gompertz優(yōu)于ANN，但數(shù)值大小相差不多，而在25、37℃這兩個(gè)溫度下3個(gè)鐘模型的數(shù)值相差較為明顯，ANN＞Gompertz＞Logistic。通過(guò)對(duì)三種評(píng)價(jià)函數(shù)的比較我們可以得出結(jié)論在擬合度、精確度、準(zhǔn)確度這3個(gè)方面，ANN即神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)均優(yōu)于其他的兩種模型，但神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)也存在著一定的局限性，一是無(wú)函數(shù)表達(dá)式，無(wú)法對(duì)函數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)學(xué)推導(dǎo)，二是存在過(guò)度擬合的局限性，一旦數(shù)據(jù)變化較大模型的形態(tài)將發(fā)生巨大變化，綜合以上述原因，本文考慮以Gompertz模型所求得的最大比生長(zhǎng)速率 μm（h－1）建立二級(jí)模型，進(jìn)一步描述最大比生長(zhǎng)速率μm（h－1）與溫度之間的函數(shù)關(guān)系。

表5 評(píng)價(jià)方法的數(shù)值結(jié)果Table 5 The result of evaluations method

2.2 二級(jí)模型的建立

根據(jù)一級(jí)模型所求得的最大生長(zhǎng)速率，利用Matlab2012a建立生長(zhǎng)速率與溫度的平方根模型，程序代碼如下

圖4 最大比生長(zhǎng)率μm與溫度間的關(guān)系Fig.4 Relationship of temperature with μm

所得擬合方程如下

方程相關(guān)系數(shù)為0.823 1，大于0.8說(shuō)明相關(guān)性較強(qiáng)，模型的建立存在一定的意義。由該方程可推算出，在溫度為8.958 0℃時(shí)最大比生長(zhǎng)速率為0，即在9℃以下金黃色葡萄球菌幾乎不生長(zhǎng)。并且，在12℃～37℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高金黃色葡萄球菌的最大生長(zhǎng)率逐漸增加。

3 結(jié)論與討論

針對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有很多影響因素，如溫度，pH，水活度等，但在原料乳中比較容易發(fā)生大范圍變化的主要是溫度，因此本文選取溫度進(jìn)行研究，12℃為運(yùn)送原料奶過(guò)程中的最高溫度，25℃為常溫，在原料乳的生產(chǎn)加工過(guò)程中比較常見(jiàn)，最后37℃為金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的最適溫度，也是奶牛體溫，原料奶的初始溫度，選取這3個(gè)具有代表性的溫度關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行研究，大大提高了該研究的實(shí)用性。在模型的建立中，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的自然對(duì)數(shù)值使得模型的擬合效果更好[11]，并且以Matlab2012a為平臺(tái)編寫(xiě)了模型的一級(jí)、二級(jí)程序及模型評(píng)價(jià)函數(shù)，解決了由于原料乳成分的復(fù)雜性而造成的生長(zhǎng)模型存在較大差異的問(wèn)題，為微生物生長(zhǎng)模型的建立提供方便。

由以上的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，針對(duì)金黃色葡萄球菌的一級(jí)生長(zhǎng)模型，ANN的擬合特性最好（見(jiàn)表5），各評(píng)價(jià)函數(shù)均優(yōu)于Gompertz和Logistic，但考慮到其過(guò)度擬合的性質(zhì)和沒(méi)有函數(shù)表達(dá)式的缺點(diǎn)，最終確定以Gompertz的一級(jí)模型所求得的最大比生長(zhǎng)率μm（h－1）建立金黃色葡萄球菌的二級(jí)模型，預(yù)測(cè)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)特性與溫度間的函數(shù)關(guān)系，在9℃～37℃范圍內(nèi)金黃色葡萄球菌的最大比生長(zhǎng)率隨溫度的升高而變大，對(duì)于9℃以下，金黃色葡萄球菌幾乎不生長(zhǎng)。生長(zhǎng)環(huán)境的不同可能導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)特性發(fā)生一定變化，這也是二級(jí)模型的相關(guān)系數(shù)僅為0.823 1的原因，因此模型無(wú)法精確的反應(yīng)金黃色葡萄球菌復(fù)雜的生長(zhǎng)特性，但能反映微生物大體的生長(zhǎng)趨勢(shì)，對(duì)乳制品生產(chǎn)過(guò)程中病原菌的檢測(cè)有一定的指導(dǎo)意義。

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