陳峰，李海龍，譚銀豐，賴偉勇

(1.海南省藥用植物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 571101)

LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅲ)

陳峰1,2，李海龍1,2，譚銀豐1,2，賴偉勇1,2

(1.海南省藥用植物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571101)

目的研究大鼠灌胃縮泉膠囊后益智中二芳基庚烷類成分(益智酮甲、益智酮乙、益智醇)在大鼠膽汁中的物質(zhì)形式。方法雄性Sprague Dawley大鼠膽管插管手術(shù)完畢經(jīng)灌胃給予縮泉膠囊(1.64 g/kg)后收集0～4 h膽汁。同體積(100 μl)的兩份膽汁樣品分別經(jīng)蛋白沉淀和β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH為5的乙酸鈉緩沖液)處理后，所得樣品利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)進(jìn)行分析。結(jié)果在大鼠膽汁中幾乎檢測不到益智二芳基庚烷類成分的原形物質(zhì)形式，而是以葡萄糖醛酸結(jié)合物的形式存在。這些二相代謝物經(jīng)酶水解處理后代謝物的色譜峰消失，釋放出二芳基庚烷類成分的原形物質(zhì)。結(jié)論大鼠灌胃給藥后經(jīng)腸道吸收的二芳基庚烷類成分在膽汁中形成葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物，酶水解可以釋放出原形物質(zhì)形式。本研究可以幫助我們理解這類物質(zhì)的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，也為后期的定量分析工作奠定基礎(chǔ)。

縮泉膠囊；益智；二芳基庚烷類；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

縮泉丸源于宋代《魏氏家藏方》[1]，由益智仁、烏藥和山藥組成，用于治療多尿、尿頻、遺尿，被2010版《中國藥典》一部收載[2]，是治療尿失禁的為數(shù)不多的中藥之一。方中以益智仁溫補(bǔ)腎之陽，固氣澀精為君藥?？s泉丸在國內(nèi)9家企業(yè)生產(chǎn)(其中8個(gè)為水丸，1個(gè)為膠囊)，其中縮泉膠囊在2012年的銷售額達(dá)到5 000萬元?？s泉丸多成分體內(nèi)過程研究較為薄弱，機(jī)體如何處置縮泉丸中的化學(xué)物質(zhì)尚待闡明。本課題組前期分析了縮泉丸中主要成分的含量[3]，并對大鼠灌胃縮泉丸后主要成分益智酮甲在大鼠系統(tǒng)中的暴露進(jìn)行了初步研究[4]。針對君藥中黃酮類物質(zhì)的膽汁排泄已經(jīng)進(jìn)行了研究(另文發(fā)表)，本文主要探討二芳基庚烷類成分在大鼠膽汁中的物質(zhì)形式，以了解這類物質(zhì)的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

1 材料與方法

1.1 試藥益智酮甲、益智酮乙和益智醇購自凱方醫(yī)藥科技(上海)有限公司，以上化合物的純度均在98%以上，結(jié)構(gòu)、分子式和分子量見圖1。β-葡萄糖醛酸水解酶(HP-2型，來自海曼蝸牛，每毫升含有100 000 U的β-葡萄糖醛酸水解酶和7 500 U的硫酸酯酶水解酶)購自Sigma公司?？s泉膠囊購自湖南漢森藥業(yè)有限公司(批號(hào)110602)。

圖1 益智酮甲、益智酮乙和益智醇的結(jié)構(gòu)式

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、給藥和樣品采集同“LC-MS/ MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)”。

1.3 膽汁樣品的處理甲醇沉淀：同“LC-MS/ MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)”。酶水解：同“LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅱ)”。

1.4 LC-MS/MS分析方法

1.4.1 色譜條件同“LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)”。

1.4.2 質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件同“LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)”。益智酮甲、益智酮乙和益智醇檢測離子對分別為313.2→136.9，311.2→117.0和315.3→137.0。上述3個(gè)二芳基庚烷類成分的二相代謝產(chǎn)物的檢測離子對分別為益智酮甲葡萄醛酸化代謝物489.2→313.2，益智酮甲硫酸酯結(jié)合物393.2→313.2，益智酮乙葡萄醛酸化代謝物487.2→311.2，益智酮乙硫酸酯結(jié)合物391.2→311.2，益智醇葡萄醛酸化代謝物491.3→315.3和益智醇硫酸酯代謝物395.3→315.3。

2 結(jié)果

2.1 膽汁中益智酮甲的測定大鼠灌胃縮泉膠囊后，膽汁樣品經(jīng)甲醇沉淀后，檢測不到益智酮甲的原形物質(zhì)(保留時(shí)間為6.90 min)，主要是益智酮甲的葡萄糖醛酸結(jié)合物(保留時(shí)間為5.72 min)，見圖2。相同來源的膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后葡萄糖醛酸結(jié)合物被水解，釋放出益智酮甲的原形物質(zhì)，見圖3。

2.2 膽汁中益智酮乙的測定大鼠灌胃縮泉膠囊，膽汁樣品經(jīng)甲醇沉淀后益智酮乙的原形物質(zhì)(保留時(shí)間為7.14 min)幾乎檢測不到，可以檢測到益智酮乙的葡萄糖醛酸結(jié)合物(保留時(shí)間為5.57 min)，見圖4。大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后葡萄糖醛酸結(jié)合物被水解，釋放出益智酮乙的原形物質(zhì)(保留時(shí)間7.11 min)，但響應(yīng)比較低，見圖5。

圖2 甲醇沉淀處理后益智酮甲及二相代謝產(chǎn)物的測定

圖3 酶水解處理后益智酮甲及二相代謝產(chǎn)物的測定

圖4 甲醇沉淀處理后益智酮乙及二相代謝產(chǎn)物的測定

圖5 酶水解處理后益智酮乙及二相代謝產(chǎn)物的測定

2.3 膽汁中益智醇的測定大鼠灌胃縮泉膠囊，膽汁樣品經(jīng)甲醇沉淀后檢測不到益智醇的原形物質(zhì)(保留時(shí)間為6.88 min)，主要是益智醇的葡萄糖醛酸結(jié)合物(保留時(shí)間為5.71 min)，結(jié)果見圖6。膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后葡萄糖醛酸結(jié)合物被水解，釋放出益智醇的原形物質(zhì)，見圖7。

圖6 甲醇沉淀處理后益智醇及二相代謝產(chǎn)物的測定

圖7 酶水解處理后益智醇及二相代謝產(chǎn)物的測定

3 討論

二芳基庚烷類成分(益智酮甲、益智酮乙和益智醇)是益智的代表性化學(xué)成分，也是縮泉膠囊中一類主要活性物質(zhì)。益智酮甲和益智酮乙具有抗炎、抗腫瘤、抗菌和胃保護(hù)作用[5-9]。在縮泉膠囊中益智酮甲是益智酮乙含量的20倍以上，而益智酮乙和益智醇含量相當(dāng)[3]。大鼠灌胃給予縮泉膠囊后，血漿中檢測到微量的游離型益智酮甲，未檢測到益智酮乙[4]。這些成分有可能存在明顯的首過消除。

通過本文的研究，我們發(fā)現(xiàn)在大鼠膽汁樣品中幾乎檢測不到游離型的益智酮甲、益智酮乙和益智醇，這些物質(zhì)多轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸結(jié)合物。經(jīng)β-葡萄糖醛酸水解酶孵化處理，釋放出原形物質(zhì)形式。盡管如此，益智酮乙的響應(yīng)也是很低的，一方面是因?yàn)橹苿┲械暮枯^低。另一方面，在大鼠體內(nèi)，這些二芳基庚烷類成分存在代謝轉(zhuǎn)化，益智酮乙還原為益智酮甲，再還原為益智醇(另文發(fā)表)。

因此，益智二芳基庚烷類成分在大鼠體內(nèi)存在明顯的膽汁消除。本文的研究可以幫助我們理解這類物質(zhì)的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，也為定量分析工作奠定基礎(chǔ)。

[1]孫世發(fā).縮泉丸方來源淺析[J].中醫(yī)雜志,1994,35(7):439.

[2]國家藥典委員會(huì).《中國藥典》2010版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社.2010:1218.

[3]Chen F,Li HL,Li YH,et al.Quantitative analysis of the major constituents in Chinese medicinal preparation SuoQuan formulae by ultra fast high performance liquid chromatography/quadrupole tandem mass spectrometry[J].Chem Cent J,2013,7(1):131.

[4]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Validated method to measure yakuchinone A in plasma by LC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study in rats[J].Chem Cent J,2014,8(1):2.

[5]Lin RJ,Yen CM,Chou TH,et al.Antioxidant,anti-adipocyte differentiation,antitumor activity and anthelmintic activities against Anisakis simplex and Hymenolepis nana of yakuchinone A from Alpinia oxyphylla[J].BMC ComplementAltern Med,2013,13:237.

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Identification of metabolites in bile of rat with Suoquan Capsules using LC-MS/MS(Ⅲ).

CHEN Feng1,2,LI

Hai-long1,2,TAN Yin-feng1,2,LAI Wei-yong1,2.
1.Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs,Haikou 571101,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo identify the diarylheptanoids(yakuchinone A,yakuchinone B and oxyphyllacinol) and their metabolites in rat bile after oral administration of Suoquan capsules.MethodsCannulas were surgically inserted into the bile duct of male Sprague-Dawley rats(n=3)under anesthesia(pentobarbital,50 mg/kg,i.p.)and bile was collected for 4 h after oral administration of Suoquan capsules(1.64 g/kg,suspended in 0.5%w/v sodium carboxymethycellulose).After methanol precipitation or β-glucuronidase(1 000 units/ml in pH 5 acetate buffer)treatment, these chemicals and their phaseⅡmetabolites in rat bile samples were analyzed via liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)with selected reaction monitoring mode.ResultsThe parent compounds could not be measured in rat bile sample treated by methanol precipitation.On the contrast,glucuronidated metabolites were recovered in rat bile.After enzymatic hydrolysis treatment via β-glucuronidase,the corresponding parent chemicals were librated from their conjugated forms.ConclusionAfter oral administration,the absorbed diarylheptanoids were partly biotransformed to glucuronide conjugates and excreted into rat bile.This study is helpful for better understanding of these diarylheptanoids’fates in rat and quantitative analysis of these compounds in rat bile samples in the future.

Suoquan Capsules;Alpinia oxyphylla(Yizhi);Diarylheptanoids;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2014）17—2503—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.0981

2014-03-04)

2011年海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：812189，813188，813196)，海南醫(yī)學(xué)院青年培育基金項(xiàng)目(編號(hào)：HY2012-013)

賴偉勇。E-mail：13807660389@163.com