陳玉靜，黃小波，陳文強(qiáng)，王寧群

遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響

陳玉靜，黃小波，陳文強(qiáng)，王寧群

目的觀察遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)體外培養(yǎng)的胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖分化的影響。方法利用無(wú)血清DMEM/F12體外培養(yǎng)技術(shù)從新生Wistar大鼠大腦海馬中培養(yǎng)NSCs，添加不同濃度(0、1、2、4 μg/ml)遠(yuǎn)志皂苷元。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對(duì)NSCs及其分化后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果培養(yǎng)的NSCs能夠表達(dá)Nestin，并具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力。在同一接種密度條件下，遠(yuǎn)志皂苷元干預(yù)組的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少(P＜0.05)，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增加(P＜0.05)。結(jié)論遠(yuǎn)志皂苷元能促進(jìn)新生大鼠大腦海馬NSCs的分化。

遠(yuǎn)志皂苷元；神經(jīng)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞分化；大鼠

[本文著錄格式]陳玉靜，黃小波，陳文強(qiáng)，等.遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2014,20(11):1028-1030.

在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)，主要分布在海馬、紋狀體、腦室下區(qū)、嗅球以及發(fā)育過(guò)程中的大腦皮質(zhì)和脊髓[1]。NSCs是一類具有多向分化和自我更新能力的細(xì)胞[2-3]，位于海馬部位的NSCs經(jīng)增殖分化產(chǎn)生的神經(jīng)發(fā)生與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[4]。本實(shí)驗(yàn)從新生大鼠大腦海馬中分離、培養(yǎng)成細(xì)胞懸浮球，經(jīng)鑒定呈Nestin陽(yáng)性，表明為NSCs。觀察中藥提取物遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)其增殖分化的影響，以研究遠(yuǎn)志皂苷元的神經(jīng)元保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新生Wistar大鼠：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

鼠抗Nestin、鼠抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體：SIGMA公司。免疫熒光二抗FITC羊抗兔、抗鼠IgG以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)試劑：CHEMICON公司；神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM/F12加B27)、添加20 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和20 ng/ ml表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)：GIBCO公司。遠(yuǎn)志皂苷元：中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2方法

1.2.1 原代培養(yǎng)

新生當(dāng)天Wistar大鼠，乙醇消毒后斷頭取腦，取雙側(cè)大腦皮質(zhì)置D-Hanks液中；剝離腦膜及血管，用眼科剪剪碎成糊狀，加DMEM/F12培養(yǎng)液(Hyclone)；細(xì)口吸管機(jī)械吹打，200目金屬濾網(wǎng)過(guò)濾，獲得單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。以5×105/ml細(xì)胞濃度接種到培養(yǎng)瓶中，加入2%B27、終濃度20 ng/ml EGF和bFGF，置5%CO2恒溫孵箱中37℃培養(yǎng)。3～4 d半量補(bǔ)液。培養(yǎng)7～9 d后，機(jī)械分離神經(jīng)球進(jìn)行傳代。

1.2.2 傳代培養(yǎng)

將原代培養(yǎng)7～9 d形成的神經(jīng)球(50～200細(xì)胞/球)懸液移至離心管，1200 r/min離心5 min，共3次，吸棄上清液。機(jī)械吹打制成單細(xì)胞懸液，以5×105/ml細(xì)胞濃度接種培養(yǎng)。6～8 d傳代1次。

1.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞的分化及遠(yuǎn)志皂苷元的誘導(dǎo)作用

收集培養(yǎng)的第2代神經(jīng)球，以2×105/ml細(xì)胞濃度接種于24孔培養(yǎng)板各孔中?？椎追胖妙A(yù)先用100 mg/L多聚賴氨酸處理過(guò)的蓋玻片。每板分對(duì)照組，遠(yuǎn)志皂苷元低(1 μg/ml)、中(2 μg/ml)和高(4 μg/ml)劑量組，每組6孔。對(duì)照組培養(yǎng)液為原培養(yǎng)液去除bFGF及EGF，另加10%胎牛血清(FBS)配制。遠(yuǎn)志皂苷元組培養(yǎng)液在對(duì)照組培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上加入不同劑量遠(yuǎn)志皂苷元。培養(yǎng)板置飽和濕度、37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞鑒定

增殖期測(cè)定NSC標(biāo)志物Nestin。各組分化培養(yǎng)7 d時(shí)，測(cè)定Nestin以及神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物NSE和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP。

取出各孔蓋玻片，4%多聚甲醛固定，PBST漂洗5 min，共3次。用含0.3%Triton X-100的PBST破膜30 min，山羊血清37℃封閉30 min；一抗分別為單克隆鼠抗Nestin(1∶100)、鼠抗NSE(1∶500)和多克隆兔抗GFAP(1∶50)；滴加相應(yīng)的FITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶500)，37℃避光孵育1 h；PBST漂洗5 min，共3次。使用50 μg/ml DAPI復(fù)染核，室溫孵育20 min；PBST漂洗5 min，共3次。Olympus倒置相差熒光顯微鏡及普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。采用Kodak圖像分析系統(tǒng)及Image-Proplus軟件測(cè)量突起長(zhǎng)度。

圖1 神經(jīng)球(第8天，400×)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NSCs生長(zhǎng)狀態(tài)

培養(yǎng)第1天細(xì)胞呈圓形亮點(diǎn)；第2～3天可見(jiàn)有數(shù)個(gè)細(xì)胞形成的啞鈴樣結(jié)構(gòu)；第4～5天可見(jiàn)幾十個(gè)細(xì)胞形成的神經(jīng)球(neurosphere)；第6天可見(jiàn)神經(jīng)球明顯增大，直徑100～150 μm；第8～10天，大的神經(jīng)球直徑已達(dá)到150～200 μm(圖1)。原代及多次傳代培養(yǎng)形成克隆球的細(xì)胞圓潤(rùn)飽滿，界清晰，活力狀態(tài)佳。Nestin表達(dá)陽(yáng)性(圖2)。

2.2 細(xì)胞分化

在去除bFGF及EGF，加10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，NSCs部分分化為NSE陽(yáng)性的神經(jīng)元(圖3)和GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖4)。NSE陽(yáng)性神經(jīng)元的胞體呈圓形，有較長(zhǎng)軸突。GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體稍小，胞突長(zhǎng)而直，分支較少。

添加遠(yuǎn)志皂苷元培養(yǎng)7 d后，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少(P＜0.05)，NSE和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增多(P＜0.05)。隨遠(yuǎn)志皂苷元濃度增加，NSE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多(P＜0.05)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞分化情況(CD)

圖2 Nestin染色(400×)

圖3 NSE染色(400×)

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征性病理變化為淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、基底前腦和海馬區(qū)的神經(jīng)元減少。AD中醫(yī)辨證多屬“腎精虧損，髓?？仗摗??！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中提出“腎生髓”理論，現(xiàn)代研究證實(shí)，“腎生髓”理論與AD明顯相關(guān)[5]，臨床上治療AD多從補(bǔ)腎論治。補(bǔ)腎填髓中藥能促進(jìn)神經(jīng)元代謝，激活內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)元存活與再生。

AD腦的神經(jīng)再生過(guò)程受到嚴(yán)重?fù)p害，這可能是導(dǎo)致認(rèn)知功能進(jìn)行性減退的重要病理機(jī)制之一。成年海馬的神經(jīng)發(fā)生與空間認(rèn)知功能有關(guān)[6-7]；如能促進(jìn)成年神經(jīng)發(fā)生可以增強(qiáng)空間記憶功能，而抑制神經(jīng)發(fā)生可出現(xiàn)空間記憶功能的下降[8]。

1992年，Reynolds等首先從成年鼠紋狀體中分離出NSCs。NSCs是一類較原始的神經(jīng)細(xì)胞，存在于胚胎和成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛區(qū)域，具有自我更新和增殖的能力，可表達(dá)特殊標(biāo)志蛋白Nestin[9]。NSCs具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力。探索NSCs的定向分化已經(jīng)成為備受關(guān)注的焦點(diǎn)。

研究表明，中藥不僅可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，提高神經(jīng)元抵抗損傷的能力，而且能促進(jìn)NSCs的增殖，并誘導(dǎo)其定向分化為功能性神經(jīng)元。

中藥遠(yuǎn)志具有寧心安神、祛痰開竅的作用，近年來(lái)在抗衰老、益智、抗氧化等方面的研究較多[10]，能夠抗氧化、清除自由基[11-12]。

遠(yuǎn)志皂苷元是遠(yuǎn)志的主要活性成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志皂苷元可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志皂苷元能夠抑制tau蛋白磷酸化，能夠?qū)辜谆叶┮鸬募?xì)胞毒性，具有保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用[14-16]。

圖4 GFAP染色(400×)

本研究結(jié)果提示，遠(yuǎn)志皂苷元可促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化。綜合以前的研究結(jié)果，遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制可能是多方面的。促進(jìn)海馬中NSCs向神經(jīng)元分化的神經(jīng)再生機(jī)制可能是其中之一。

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Effect of Tenuigenin on Differentiation of Neural Stem Cells from Hippocampus of Newborn Rats

CHEN Yu-jing,HUANG Xiao-bo, CHEN Wen-qiang,WANG Ning-qun.Xuanwu Hospital,Capital Medical University,Beijing 100053,China

ObjectiveTo observe the effect of tenuigenin on differentiation of hippocampal neural stem cells(NSCs).MethodsNSCs isolated from newborn(within 24 h)Wistar rats hippocampus were cultivated in vitro with serum free and clone culturing technology.Tenuigenin of different doses(0,1,2,4 μg/ml)were added in the medium,and the proliferation and differentiation of the cells were identified with immunofluorescence staining.ResultsThe neural spheres obtained from the hippocampi of newborn rats were positive for Nestin expression,with the potential for further cloning and differentiation into neurons or glial cells.The incidence of neuron specific enolase and glial fibrillary acidic protein positive cells increased in all the tenuigenin groups compared to the control(P＜0.05),while the Nestin positive cells decreased(P＜0.05).ConclusionTenuigenin may promote the differentiation of neural stem cell into nerve cell.

tenuigenin;neural stem cells;cell culturing;cell differentiation;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.11.008

R742

A

1006-9771(2014)11-1028-03

2014-01-13

2014-02-08)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81102624)。

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中醫(yī)科，北京市100053。作者簡(jiǎn)介：陳玉靜(1979-)，女，漢族，吉林吉林市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：腦病的中醫(yī)藥防治研究。