龍志華，高飛，張鋒良，岳軍忠，王磊，王燁，劉文國(guó)，徐青

大鼠脊髓損傷后P物質(zhì)與神經(jīng)源性腸道功能障礙的關(guān)系

龍志華，高飛，張鋒良，岳軍忠，王磊，王燁，劉文國(guó)，徐青

目的探討脊髓損傷后結(jié)腸中P物質(zhì)與神經(jīng)源性腸道功能障礙的關(guān)系。方法60只體質(zhì)量(220±40)g的雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=20)、正常對(duì)照組(n=20)和模型組(n=20)。氯胺酮60 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，利用NYU脊髓打擊器，以75 g?cm致傷力制作T10脊髓損傷模型，分別于造模后24 h、1周、3周和5周時(shí)切除大鼠結(jié)腸組織制作標(biāo)本，檢測(cè)腸道傳輸功能，采用ELISA方法測(cè)定血清中和組織中的P物質(zhì)含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting法檢測(cè)P物質(zhì)mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠脊髓損傷后出現(xiàn)腸道傳輸功能下降，且于造模后3周時(shí)腸道傳輸達(dá)到最低值；造模后3周時(shí)模型組血清和組織中P物質(zhì)含量與假手術(shù)組相比均降低，結(jié)腸組織中P物質(zhì)的mRNA及蛋白表達(dá)水平也下調(diào)，與假手術(shù)組、正常對(duì)照組相比具有顯著性差異，假手術(shù)組P物質(zhì)的表達(dá)是模型組的(3.12±0.51)倍(P＜0.05)。結(jié)論大鼠脊髓損傷后神經(jīng)源性腸道功能障礙與結(jié)腸中P物質(zhì)的表達(dá)降低有關(guān)。

脊髓損傷；P物質(zhì)；神經(jīng)源性腸道功能障礙；大鼠

[本文著錄格式]龍志華，高飛，張鋒良，等.大鼠脊髓損傷后P物質(zhì)與神經(jīng)源性腸道功能障礙的關(guān)系[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20(8):718-722.

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)不僅嚴(yán)重地?fù)p害患者的軀體感覺和運(yùn)動(dòng)功能，且對(duì)胃腸神經(jīng)系統(tǒng)造成影響使得胃腸運(yùn)動(dòng)、肛門括約肌功能及肛門反射、排便協(xié)調(diào)性等發(fā)生改變，導(dǎo)致患者發(fā)生神經(jīng)源性腸道功能障礙(neurogenic bowel dysfunction,NBD)[1]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，41%的脊髓損傷患者認(rèn)為NBD嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。在脊髓損傷患者中高達(dá)1/3出現(xiàn)NBD，主要表現(xiàn)為便秘、腹脹以及大便失禁等[2-4]。

隨著對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)研究的深入，對(duì)慢性傳輸型便秘發(fā)病機(jī)理有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。但脊髓損傷后腸神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸激素的作用機(jī)理及改變的相關(guān)研究嚴(yán)重滯后。本文擬對(duì)大鼠脊髓損傷后出現(xiàn)的NBD與胃腸激素中P物質(zhì)之間的關(guān)系進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物與分組60只健康雄性Sprague-Dawley大鼠(編號(hào)：RD008)，體質(zhì)量(220±40)g，SPF級(jí)，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：SCK-(軍)2009-005。

飼養(yǎng)條件：室溫16～25℃，相對(duì)濕度50%～70%，分籠飼養(yǎng)，飼以普通飼料，環(huán)境清潔安靜。

采用抽簽法隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=20)、正常對(duì)照組(n=20)和模型組(n=20)，每組又分為造模后24 h、1周、3周和5周共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠。各組間大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。飼養(yǎng)1周后開始建立脊髓損傷模型。

1.1.2 主要試劑粉末活性炭(分析純)(臺(tái)山市聯(lián)興化工有限公司)；BCA Protein Assay Kit(PIERCE公司，美國(guó))；SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司，美國(guó))；大鼠P物質(zhì)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢伊艾博科技有限公司)；抗P物質(zhì)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、化學(xué)發(fā)光試劑盒(SANTA CRUZ公司，美國(guó))；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗GAPDH抗體(中國(guó)康成公司)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(INVITROGEN公司，美國(guó))；RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，德國(guó))。

1.1.3 動(dòng)物模型制備氯胺酮60 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，利用NYU脊髓打擊器(美國(guó)，紐約大學(xué))以75 g?cm致傷力制作T10脊髓損傷模型[5]。

脊髓損傷模型成功的標(biāo)志為，在打擊器撞擊脊髓的瞬間，動(dòng)物身體抖動(dòng)，雙下肢迅速回縮并出現(xiàn)彈動(dòng)動(dòng)作，尾巴翹起并迅速倒下，打擊局部脊髓表面迅速呈瘀紫色，術(shù)后雙下肢出現(xiàn)完全癱瘓。

取每個(gè)試件中通過位移傳感器測(cè)量的工字鋼豎向相對(duì)位移的平均值為橫坐標(biāo)，取加載試驗(yàn)機(jī)的荷載值為縱坐標(biāo).試驗(yàn)以單調(diào)靜力加載方式對(duì)試件進(jìn)行加載，以200 kN為單位進(jìn)行測(cè)量讀數(shù)，讀取試件的豎向位移.最后得到試件的荷載位移曲線.

假手術(shù)組大鼠同法暴露T10段脊髓，但不造成脊髓打擊傷。

正常對(duì)照組大鼠不做任何處理。

1.1.4 取材手術(shù)后大鼠用普通飼料飼養(yǎng)，各時(shí)間點(diǎn)大鼠禁食24 h后，暴露腹腔，下腔靜脈采血置于含抑肽酶40μl的清潔試管中，室溫下血液自然凝固2 h，1000 g離心20min，取上清置于-80℃冰箱保存待測(cè)。

經(jīng)口灌入活性炭懸液10 ml/kg(懸液濃度100 g/ L)，30min后氯胺酮60 mg/kg腹腔注射麻醉，立即剖腹取出幽門至直腸末端的全部腸管并測(cè)量。迅速切取結(jié)腸中段腸管，用生理鹽水沖去腸內(nèi)容物以及黏膜表面粘附的糞便、分泌物和血液后，將結(jié)腸壁組織切成1.5×1.5×1.5 mm的小塊迅速置于-80℃冰箱內(nèi)保存，用于提取結(jié)腸組織總RNA和總蛋白。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 腸道傳輸功能測(cè)定采用活性炭懸液推進(jìn)法，在無張力狀況下用直尺測(cè)量腸道全長(zhǎng)及活性炭混懸液在腸道內(nèi)推進(jìn)長(zhǎng)度，并計(jì)算活性炭懸液推進(jìn)長(zhǎng)度占腸道全長(zhǎng)的百分比(黑染腸管長(zhǎng)度/腸道總長(zhǎng)度×100%)，最后計(jì)算每組的平均值[6-7]。

1.2.2 P物質(zhì)測(cè)定結(jié)腸組織用預(yù)冷生理鹽水洗去血液，濾紙吸干，按1∶9(結(jié)腸組織∶生理鹽水)加入生理鹽水制備組織勻漿，1000 g離心20min，取上清待測(cè)。

將制備好的血清樣品和組織上清應(yīng)用大鼠P物質(zhì)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，按說明書測(cè)定血清中及組織上清中P物質(zhì)含量。利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀，在450nm處測(cè)定各孔的平均光密度值(mean density,MD)，采用Curve2Expert 113進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，并計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度值。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)①組織總RNA的提?。喊凑誕IAGEN?RNeasy Mini Kit說明書的操作方法提取結(jié)腸組織總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度。

②反轉(zhuǎn)錄方法制備cDNA：將稀釋后的總RNA 2 μg、Oligo(dT)15 0.5 μl、10 mmol/L dNTP 1 μl、超純水6.5 μl，依次加入PCR反應(yīng)管中，65℃反應(yīng)5min，立即轉(zhuǎn)入冰浴中，短暫離心后，加入5×第一鏈緩沖液4 μl，0.l mmol/L二硫蘇糖醇2 μl、M-MLV 200 U(1 μl)、超純水1 μl，輕輕混勻，短暫離心，37℃，50min；70℃，l5min終止反應(yīng)，冰浴冷卻，并以不加逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)體系作為陰性對(duì)照。

③繪制引物標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)P物質(zhì)的cDNA序列，通過Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物。以某一個(gè)樣本的4個(gè)不同量的cDNA為模板(100 ng、50 ng、25 ng、10 ng)做實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(ABI 7300)，反應(yīng)條件：95℃，10min；95℃，15 s；60℃，1min，共50個(gè)循環(huán)。將所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。將每個(gè)反應(yīng)的Ct值與其cDNA加入量(ng)的lg值進(jìn)行線性相關(guān)分析，計(jì)算其斜率。當(dāng)斜率在-3.6～-3.0范圍內(nèi)時(shí)，認(rèn)為該反應(yīng)的Ct值與相對(duì)應(yīng)的模板量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。故選取斜率位于-3.6～-3.0的引物序列待用。

④樣本測(cè)定：使用選定的引物對(duì)樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)，將檢測(cè)的臨界點(diǎn)設(shè)定在PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)(Ct)作為模板初始濃度的間接指標(biāo)，熔解曲線分析采用默認(rèn)條件。結(jié)果用18S RNA進(jìn)行校正。用ΔCt法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)，確定P物質(zhì)mRNA的相對(duì)濃度。在實(shí)時(shí)定量分析中所得的熒光值可以反映目的產(chǎn)物的含量，各組所測(cè)得P物質(zhì)的Ct值與18S RNA的Ct值的差值為ΔCt。各實(shí)驗(yàn)組的ΔCt與正常對(duì)照組ΔCt值的差值為ΔΔCt。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)在4℃條件下，加入裂解液提取結(jié)腸組織中的蛋白，用BCA Protein Assay Kit測(cè)定樣品蛋白含量。每個(gè)樣本取蛋白50 μg進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉4 h，加入1∶500 P物質(zhì)兔多克隆抗體于4℃孵育過夜，TBST漂洗2次，每次5min，加入1∶10000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST漂洗6次，每次5min，將膜用化學(xué)發(fā)光試劑孵育1min，于X線片上曝光，常規(guī)顯影、定影。洗膜后孵育GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參，將結(jié)果用Genetools軟件(PerklmElmer)進(jìn)行密度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腸道傳輸功能測(cè)定

造模后1周，模型組有1只因術(shù)后感染死亡，其余4只動(dòng)物與假手術(shù)組結(jié)腸長(zhǎng)度無顯著性差異(P＞0.05)，正常對(duì)照組與假手術(shù)組結(jié)腸長(zhǎng)度也無顯著性差異(P＞0.05)；造模后24 h、3周和5周，模型組與假手術(shù)組結(jié)腸長(zhǎng)度均無顯著性差異，正常對(duì)照組與假手術(shù)組結(jié)腸長(zhǎng)度也均無顯著性差異(P＞0.05)。

腸道傳輸功能測(cè)定發(fā)現(xiàn)，模型組造模后3周腸道傳輸功能達(dá)到最低值，造模后5周腸道傳輸功能開始升高，且造模后3周和5周模型組與假手術(shù)組相比降低(P＜0.05)，正常對(duì)照組與假手術(shù)組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。因此，造模后3周出現(xiàn)NBD的脊髓損傷動(dòng)物模型造成結(jié)腸腸道傳輸功能減慢。

表1 結(jié)腸傳輸功能比較

2.2 血清和結(jié)腸組織中P物質(zhì)變化

模型組大鼠脊髓損傷后24 h和1周，血清中P物質(zhì)含量降低，傷后3周達(dá)最低值，傷后5周上升。見圖1。傷后3周，模型組血清中P物質(zhì)含量與假手術(shù)組和正常對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。見圖2。傷后5周，模型組血清中P物質(zhì)含量與假手術(shù)組和正常對(duì)照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。傷后3周，模型組結(jié)腸組織中P物質(zhì)含量與假手術(shù)組比較降低(P＜0.05)，正常對(duì)照組與假手術(shù)組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見圖3。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)血清中P物質(zhì)含量變化

圖2 傷后3周血清中P物質(zhì)的含量

圖3 傷后3周結(jié)腸組織中P物質(zhì)的含量

2.3 結(jié)腸組織中P物質(zhì)mRNA表達(dá)水平變化

選用表2所示的P物質(zhì)引物序列測(cè)定大鼠結(jié)腸組織中P物質(zhì)在mRNA水平的表達(dá)情況。取大鼠脊髓損傷造模后3周的組織提取總RNA，測(cè)定mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，大鼠在脊髓損傷造模后3周，假手術(shù)組P物質(zhì)的表達(dá)是模型組的(4.52±0.35)倍(P＜0.05)，而假手術(shù)組與正常對(duì)照組相比無顯著性差異(P＞0.05))。見圖4。

表2 P物質(zhì)引物序列

圖4 P物質(zhì)基因mRNA在各組結(jié)腸組織中的表達(dá)

2.4 結(jié)腸組織中P物質(zhì)蛋白表達(dá)水平變化

取大鼠脊髓損傷造模后3周的組織提取總蛋白進(jìn)行Western blotting測(cè)定。結(jié)果顯示，大鼠在脊髓損傷造模后3周，假手術(shù)組P物質(zhì)的表達(dá)是模型組的(3.12± 0.51)倍(P＜0.05)，而假手術(shù)組與正常對(duì)照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。見圖5。

圖5 P物質(zhì)蛋白在各組大鼠結(jié)腸中的表達(dá)

3 討論

結(jié)腸運(yùn)動(dòng)受神經(jīng)和胃腸激素的支配與調(diào)節(jié)。胃腸肽類激素是由胃腸道管壁上散在的內(nèi)分泌細(xì)胞和胰腺的胰島分泌的高效能生物活性物質(zhì)，它們與神經(jīng)系統(tǒng)一起，調(diào)節(jié)消化器官的運(yùn)動(dòng)、分泌和吸收等功能[8]。這些胃腸激素通過旁分泌、自分泌、神經(jīng)分泌等方式，介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞，使其產(chǎn)生興奮和/或抑制作用。興奮性胃腸肽激素包括胃動(dòng)素、胃泌素、內(nèi)皮素、P物質(zhì)等，抑制性胃腸肽激素包括血管活性肽、膽囊收縮素、胰泌素等。

P物質(zhì)能神經(jīng)元是腸道內(nèi)一種重要的肽能神經(jīng)元，對(duì)胃腸的運(yùn)動(dòng)功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。P物質(zhì)能神經(jīng)元胞體存在于腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)，發(fā)出的纖維分布至腸壁各層，是促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)消化道平滑肌有強(qiáng)烈刺激作用，直接作用于全結(jié)腸腸壁肌，同時(shí)激活結(jié)腸中遠(yuǎn)端膽堿能興奮通路和結(jié)腸近端非膽堿能興奮通路，并激活NO依賴的抑制性神經(jīng)通路，從而增加胃腸蠕動(dòng)[9-12]。

腸道問題是脊髓損傷患者主要的生理和心理問題，腸道問題給患者帶來的痛苦并不亞于失去運(yùn)動(dòng)能力的痛苦[13]。由于脊髓損傷后腸道的運(yùn)動(dòng)能力、括約肌的控制能力等問題使得脊髓損傷患者生活能力出現(xiàn)較大的障礙，這對(duì)患者的生活質(zhì)量也產(chǎn)生巨大影響。目前有關(guān)脊髓損傷后結(jié)腸P物質(zhì)能神經(jīng)元及P物質(zhì)含量的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。本研究旨在探討是否脊髓損傷大鼠出現(xiàn)NBD與結(jié)腸中P物質(zhì)含量的改變有關(guān)，為今后研究和治療脊髓損傷患者NBD提供可靠的理論依據(jù)。

成功建立大鼠脊髓損傷模型后，大鼠出現(xiàn)不同程度的便秘及腹脹，為實(shí)驗(yàn)奠定良好基礎(chǔ)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷造模后3周大鼠結(jié)腸傳輸功能減慢達(dá)到最低值，在造模后5周時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸傳輸略有增加，在造模后3周和5周時(shí)模型組與假手術(shù)組比較結(jié)腸傳輸功能均降低(P＜0.05)，提示大鼠結(jié)腸在造模后3周開始出現(xiàn)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能障礙。因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們選擇脊髓損傷后3周的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

研究還發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后導(dǎo)致NBD大鼠的血清和結(jié)腸組織中P物質(zhì)與假手術(shù)組比較，表達(dá)降低(P＜0.05)。之后通過PCR和Western blotting方法檢測(cè)脊髓損傷后大鼠結(jié)腸組織中P物質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸組織中P物質(zhì)的mRNA和蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比均下調(diào)(P＜0.05)。

由此可見，脊髓損傷后大鼠出現(xiàn)結(jié)腸功能障礙可能與大鼠結(jié)腸中P物質(zhì)的減少和P物質(zhì)能神經(jīng)元病變有關(guān)。

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Substance P in Neurogenic Bowel Dysfunction after Spinal Cord Injury in Rats

LONG Zhi-hua,GAO Fei,ZHANG Feng-liang,YUE Jun-zhong,WANG Lei,WANG Ye,LIU Wen-guo,XU Qing.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Department of General Surgery,Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Reserch Center,Beijing 100068,China

ObjectiveTo investigate the relationship between neurogenic bowel dysfunction(NBD)and substance P in rats suffering from spinal cord injury(SCI).Methods60 male Sprague-Dawley rats,weighted(220±40)g,were randomly divided into three groups:sham group(n=20),normal group(n=20)and model group(n=20)and then were subdivided into subgroups of 24 h,1 week,3 weeks,and 5 weeks respectively after SCI.SCI model was established at thoracic 10 segment of rat with NYU impactor device.The colon tissue of the rats was resected and stored.Substance P in serum and tissue was measured by ELISA.The tissue was examined by real-time RT-PCR and Western blotting to analyze the expression of substance P.ResultsThe colon intestinal transmission function decreased and delineated atminimum value at 3 weeks in the model group.There was statistical significance with respect to the content of substance P in serum and tissue between the sham group and model group at 3 weeks.The expression of substance P in the sham group was(3.12±0.51)times of the model group(P＜0.05).ConclusionSubstance P may take part in NBD after SCI in rats.

spinal cord injury;substance P;neurogenic bowel dysfunction;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.08.004

R651.2

A

1006-9771(2014)08-0718-05

2014-03-26

2014-04-11)

中國(guó)康復(fù)研究中心青年基金項(xiàng)目(No.2009-Q4)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；2.中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院，北京市100068。作者簡(jiǎn)介：龍志華(1976-)，男，漢族，湖南安仁縣人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要研究方向：胃腸外科。通訊作者：徐青，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail:tsingcrrc@sina.cn。

時(shí)間：2014-06-30 15:57

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3759.R.20140808.0913.001.html