劉少輝，劉偉，邱少汕，徐錫金

N-叔丁基-α-苯基硝酮對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

劉少輝，劉偉，邱少汕，徐錫金

目的觀察N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)對(duì)脊髓損傷大鼠脊髓組織和血清中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)蛋白表達(dá)的影響。方法174只健康雌性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量180～220 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=54)、生理鹽水(NS)對(duì)照組(n=60)和PBN組(n=60)，每時(shí)間段6只。鞘內(nèi)置管后，采用自行改制的ò型NYU裝置建立大鼠脊髓損傷模型。PBN組鞘內(nèi)注射PBN 3 mg(15μl)，NS對(duì)照組注射NS 15μl，術(shù)后30min第1次注射，連續(xù)注射7 d，每天1次。術(shù)前3 d和1 d，以及術(shù)后1 d、5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d和35 d對(duì)NS對(duì)照組和PBN組進(jìn)行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)，并在術(shù)后1 h、12 h、24 h、48 h、3 d、7 d、14 d和21 d各組取血清和脊髓組織測(cè)定NGF水平。結(jié)果術(shù)后血清中NGF蛋白含量出現(xiàn)明顯改變，而脊髓組織中含量變化不明顯。血清NGF/總蛋白比值48 h時(shí)達(dá)到峰值，NS對(duì)照組(0.92%±0.02%)與PBN組(0.77%±0.05%)相比有顯著性差異(P= 0.021)。兩組大鼠BBB評(píng)分在傷后第10天開(kāi)始升高，PBN組恢復(fù)程度明顯好于NS對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)論P(yáng)BN能有效降低脊髓損傷大鼠血清中NGF蛋白的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

脊髓損傷；自由基；N-叔丁基-α-苯基硝酮；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；大鼠

[本文著錄格式]劉少輝，劉偉，邱少汕，等.N-叔丁基-α-苯基硝酮對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20(8):709-712.

脊髓損傷(spinal cord injury)導(dǎo)致軀體運(yùn)動(dòng)與感覺(jué)神經(jīng)功能等一系列的損害。其中慢性中樞性神經(jīng)疼痛(chronic central neuropathic pain,CNP)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至是自殺的原因之一[1]。脊髓損傷后繼發(fā)產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)與中樞性痛覺(jué)敏化密切相關(guān)。活性氧及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的致炎因子與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)結(jié)合，使谷氨酸受體蛋白的磷酸化上調(diào)，谷氨酸釋放增多，誘發(fā)疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致脊髓損傷后中樞性疼痛敏化的發(fā)生[2-3]。

本研究在應(yīng)用自由基清除劑N-叔丁基-α-苯基硝酮(α-phenyl-N-tert-butylinitrone,PBN)抑制大鼠脊髓損傷后中樞性痛覺(jué)敏化表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察脊髓損傷大鼠脊髓組織和血清中NGF的變化，探討脊髓損傷后活性氧下游谷氨酸受體激活和相關(guān)細(xì)胞因子所致中樞性痛覺(jué)敏化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取174只健康成年SPF級(jí)雌性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào)：SCXK粵2006-0015)。將大鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n= 54)和脊髓挫傷組(n=120)[4]。脊髓挫傷組又分為生理鹽水(normal saline,NS)對(duì)照組(n=60)和PBN組(n=60)。各組手術(shù)前后因麻醉死亡的，從每批次組中補(bǔ)充。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用麻醉處死動(dòng)物。

1.2 脊髓損傷模型制備

用0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，腰背部脫毛，常規(guī)消毒，暴露脊髓棘突。固定T8-12棘突，咬開(kāi)T9-11棘突及T9-10椎板，充分顯露硬脊膜約1 cm，避免損傷硬脊膜[5-7]。于所暴露脊髓尾端旁側(cè)，在顯微手術(shù)鏡下，縫線針刺穿硬脊膜孔，見(jiàn)少量腦脊液流出時(shí)，將充滿相應(yīng)液體的PE-10微管向頸部方向插入約6 mm。縫扎固定于豎脊肌，穿過(guò)皮下，到達(dá)頸部，暴露出15 cm，以熱熔蠟封閉。根據(jù)Basso等[8]介紹的脊髓沖擊損傷模型，采用自行改制的ò型NYU裝置[2]，根據(jù)NYU實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)暴露脊髓大鼠的T10進(jìn)行撞擊(150 kDyne)，停留1 s。撞擊后，用傷口周圍脂肪組織填充骨缺損部位，創(chuàng)口撒上青霉素粉，分層縫合。在撞擊造成損傷后15min，鞘內(nèi)注射PBN 3 mg(15μl)。PBN注射濃度是通過(guò)組內(nèi)對(duì)比，找出能最大限度減輕機(jī)械性和溫度性異常性疼痛的劑量。NS對(duì)照組注射NS 15μl。注射后用10μl NS沖洗微管。連續(xù)注射7d，每天1次，共8次[9]。

大鼠術(shù)后3h內(nèi)開(kāi)始飲食。手術(shù)后立即使用青霉素1×106U注射，7 h后第2次注射，此后，每天1次，連續(xù)3 d以上。人工膀胱按摩排尿每天2次。所有的脊髓挫傷大鼠在4d后達(dá)到自主排尿。

1.3 取材

于術(shù)前及術(shù)后1h、12h、24h、48h、3d、7d、14d和21d每組各取6只。用0.3%戊巴比妥鈉30 mg/ kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，打開(kāi)胸腔暴露心臟與大血管，左心室抽取血液1.5 ml，置Eppendorf管，室溫下2 h，4℃冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜，3000 r/min離心15min，吸取上清液，-80℃分裝保存。采血后，在左心室插灌注導(dǎo)管，止血鉗固定并封閉采血針孔，剪開(kāi)右心耳，灌注肝素化生理鹽水200 ml(50 U/ml)沖洗，隨后灌注4℃4%多聚甲醛250 ml，取損傷節(jié)段脊髓組織[10]。

1.4 脊髓組織總蛋白提取

采用組織總蛋白提取試劑盒(ChemiKine, CN.2140)提取組織總蛋白。按照說(shuō)明要求進(jìn)行操作。吸取上清液，-80℃分裝保存。

1.5 蛋白含量檢測(cè)

血清和脊髓組織總蛋白的測(cè)定使用BCA Protein Assay Kit(Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-202389)， 562nm處測(cè)平均光密度值(OD)(RAYTO RT-2100C)。血清和脊髓組織中NGF蛋白含量測(cè)定使用大鼠NGF ELISA 96孔板試劑盒(ChemiKine,CYT304)，492nm測(cè)OD值(RAYTO RT-2100C)。按照各自說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.6 BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)(The Basso-Beattie-Bresnahan Locomotor Rating Scale)[8]

在手術(shù)前3～5 d(體質(zhì)量200～245 g)，各組剩余6只大鼠均進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)，以確定行為基線。術(shù)后1d、5d、10d、15d、20d、25d、30d和35d時(shí)分別進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)。

測(cè)試時(shí)間固定在9:00～12:00，由對(duì)分組情況不知情的測(cè)試人員在25℃安靜的環(huán)境中，將大鼠放入60× 50×45 cm的透明有機(jī)玻璃箱中，適應(yīng)20～30min，待其安靜后開(kāi)始檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SigmaStat 3.5和SigmaPlot 10.0軟件分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和制圖。計(jì)量資料用(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。顯著性水平α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清中NGF蛋白含量變化

通過(guò)檢測(cè)大鼠血清NGF濃度和血清總蛋白濃度，計(jì)算各時(shí)段NGF蛋白所占總蛋白含量的比值(見(jiàn)圖1)。結(jié)果顯示，術(shù)后48 h血清NGF/總蛋白比值迅速上升，達(dá)最高水平，且NS對(duì)照組(0.92%±0.02%)與PBN組(0.77%±0.05%)相比有顯著性差異(P=0.021)。術(shù)后第3天，NS對(duì)照組血清NGF/總蛋白比值迅速回落，而PBN組一直處于相對(duì)低水平表達(dá)狀態(tài)，在術(shù)后7 d停止給予PBN治療后略顯增加。

圖1 三組大鼠血清NGF蛋白含量變化

2.2 大鼠脊髓組織中NGF蛋白含量變化

脊髓組織中NGF蛋白含量與血清NGF蛋白含量變化總趨勢(shì)沒(méi)有明顯差異。術(shù)后12 h開(kāi)始，NS對(duì)照組各時(shí)段NGF蛋白水平出現(xiàn)波動(dòng)較大，與PBN組各時(shí)段相比無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖2)。術(shù)后7 d，PBN組NGF蛋白表達(dá)呈現(xiàn)逐步升高趨勢(shì)，但各時(shí)段組內(nèi)比較也無(wú)顯著性差異。NS對(duì)照組各時(shí)段相對(duì)PBN組NGF表達(dá)水平相對(duì)略高。

圖2 NS對(duì)照組和PBN組大鼠脊髓組織中NGF蛋白含量變化

2.3 大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況

兩組大鼠BBB評(píng)分在傷后第10天開(kāi)始各時(shí)間點(diǎn)都有非常顯著性差異(見(jiàn)圖3)，PBN組恢復(fù)程度明顯好于NS對(duì)照組。其中第20天時(shí)間點(diǎn)，NS對(duì)照組BBB評(píng)分為(4.010±0.426)，PBN組為(8.883±0.423)；第35天時(shí)間點(diǎn)，NS對(duì)照組為(9.250±0.463)，PBN組為(16.750±0.524)。各時(shí)間點(diǎn)兩組評(píng)分值之間有非常顯著性差異(P＜0.01)。

圖3 NS對(duì)照組和PBN組BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

3 討論

中樞性疼痛是脊髓損傷所致的多種慢性疼痛中的一種，包括在沒(méi)有可見(jiàn)的刺激條件下出現(xiàn)的自發(fā)痛與由刺激所誘發(fā)的傷害性刺激痛覺(jué)過(guò)敏以及非傷害性刺激的痛覺(jué)超敏誘發(fā)痛[11]。表現(xiàn)為多特征、部位廣泛的疼痛和/或感覺(jué)缺失，并隨脊髓損傷時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

脊髓損傷后中樞性疼痛的產(chǎn)生與中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性過(guò)高密切相關(guān)[1]?？赡芘c脊髓感覺(jué)下行抑制的解除，感覺(jué)傳入缺失使脊髓及丘腦感覺(jué)神經(jīng)元高度興奮，以及突觸遞質(zhì)釋放與受體活性的改變、脊髓的出芽增殖等所有可使背角神經(jīng)元保持高興奮性的改變相關(guān)。由于脊髓組織膜結(jié)構(gòu)含有豐富脂質(zhì)，脊髓損傷后組織缺血、缺氧及水腫引起活性氧產(chǎn)生增加，且清除功能下降，致使自由基在局部堆積。作為氧代謝產(chǎn)物的活性氧包括超氧自由基、過(guò)氧化氫及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等，可以參與脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA鏈斷裂、蛋白質(zhì)修飾變性及影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)，既可引起神經(jīng)細(xì)胞和組織能量代謝系統(tǒng)障礙，又可觸發(fā)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，使Ca2+超載，且使Ca2+-ATP酶失活，還可直接導(dǎo)致神經(jīng)變性壞死[12]。

脊髓組織損傷后導(dǎo)致氧自由基堆積的原因主要包括三個(gè)方面：第一是由于損傷組織缺氧，細(xì)胞能量合成減少，ATP分解增多，AMP濃度增高，黃嘌呤氧化酶被激活，作用于蓄積在細(xì)胞內(nèi)的次黃嘌呤及其他一些底物，使氧分子獲得一個(gè)電子，而形成過(guò)氧化氫、羥自由基及其他離子[13]；第二是損傷時(shí)中樞神經(jīng)元釋放大量?jī)翰璺影奉惡?-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)，這些遞質(zhì)不僅影響微血管自動(dòng)調(diào)節(jié)功能，而且在自身氧化過(guò)程中，將電子傳遞給氧分子，產(chǎn)生自由基[14]；第三是組織損傷激活磷脂酶A2，作用于花生四烯酸生成前列腺素，在前列腺素G2轉(zhuǎn)化為前列腺素H2的過(guò)程中，將電子傳遞給氧分子，產(chǎn)生超氧陰離子自由基。

由于自由基的特點(diǎn)是未配對(duì)的電子，這種未配對(duì)的電子容易脫離自由基電子軌道而成為自由電子。大量的自由電子形成損傷局部負(fù)電位，形成電位差。當(dāng)電位差達(dá)到閾值電位時(shí)，Na+、K+通道開(kāi)放，膜電位翻轉(zhuǎn)，產(chǎn)生動(dòng)作電位，引起疼痛[15]。而PBN在組織中能很好地消除堆積的活性氧，從而消除或減低疼痛的產(chǎn)生。

近年來(lái)的研究表明，活性氧誘導(dǎo)中樞性痛覺(jué)性敏化的產(chǎn)生，可能通過(guò)三個(gè)方面實(shí)現(xiàn)。

第一方面是活性氧通過(guò)激活谷氨酸受體來(lái)實(shí)現(xiàn)。谷氨酸受體廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，在脊髓背角神經(jīng)元上有特異性分布，因其受體激活，可介導(dǎo)外周傷害性信息的傳遞。

第二方面是通過(guò)促進(jìn)致炎細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-1α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-β)的產(chǎn)生[16]。如白細(xì)胞介素-1β可通過(guò)上調(diào)P物質(zhì)及NGF的表達(dá)，敏化脊髓后角神經(jīng)元，也可使脊髓神經(jīng)元處于過(guò)度興奮狀態(tài)，易化突觸，并可通過(guò)抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞清除突觸間谷氨酸，使神經(jīng)元處于高度興奮狀態(tài)[17]。

第三方面就是活性氧通過(guò)影響神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放，特別是NGF和BDNF。NGF的增加，可以導(dǎo)致BDNF的上調(diào)，后者可調(diào)控脊髓背角神經(jīng)元的功能，激發(fā)突觸效能的改變[18]。

脊髓損傷后損傷組織細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸立即增加，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸受體途徑立即被激活，包括細(xì)胞內(nèi)Ca2+、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase,COX-2)介導(dǎo)的前列腺素途徑活性增強(qiáng)，導(dǎo)致活性氧的形成。當(dāng)二次損傷進(jìn)一步加深時(shí)，由于氧化應(yīng)激結(jié)果促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量致炎細(xì)胞因子[19]，使外周血液中的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)到脊髓實(shí)質(zhì)，浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞可以分泌NGF，從而導(dǎo)致初級(jí)傳入神經(jīng)的敏化[20]。

通常脊髓損傷后1 h為脊髓谷氨酸波動(dòng)末期，6 h時(shí)脊髓中一些促炎細(xì)胞因子達(dá)到高峰，24 h時(shí)中性白細(xì)胞產(chǎn)生達(dá)到高峰，48 h時(shí)血清中NGF水平達(dá)到高峰，第14天部分大鼠中開(kāi)始出現(xiàn)異常性疼痛，第35天時(shí)所有大鼠出現(xiàn)異常性疼痛。

本研究結(jié)果與上述病理機(jī)制基本一致。48 h時(shí)血清中NGF蛋白含量迅速增加，達(dá)最高水平，且NS對(duì)照組與PBN組相比較有顯著性差異。術(shù)后第3天，NS對(duì)照組血清NGF/總蛋白比值迅速回落，而PBN組血清NGF蛋白一直處于相對(duì)低水平表達(dá)狀態(tài)，在術(shù)后7 d停止給予PBN治療后略顯增加。表明PBN能夠有效清除損傷組織產(chǎn)生的活性氧，并降低活性氧引起的二次損傷。同時(shí)也表明，脊髓損傷后血清NGF蛋白的增加與活性氧激活密切相關(guān)。為進(jìn)一步闡明脊髓損傷后活性氧下游谷氨酸受體激活和相關(guān)細(xì)胞因子所致中樞性痛覺(jué)敏化的機(jī)制以及臨床動(dòng)態(tài)觀察抗氧化劑的治療效價(jià)提供依據(jù)。

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Effect of α-phenyl-N-tert-butylinitrone on Expression of Nerve Growth Factor in Spinal Cord Injured Rats

LIU Shao-hui,LIU Wei, QIU Shao-shan,XU Xi-jin.Department of Cell Biology and Genetics,Shantou University Medical College,Shantou,Guangdong 515041, China

ObjectiveTo explore the effect of α-phenyl-N-tert-butylinitrone(PBN)on expression of nerve growth factor(NGF)in serum and spinal cord tissue in rats after spinal cord injury(SCI).Methods174 female Sprague-Dawley rats were randomly assigned to following groups:normal control group(n=54),normal saline control group(NS group,n=60,intrathecally injected normal saline 15μl),and PBN group(n=60,intrathecally injected PBN,3 mg,15μl).The model was established with New York University blow device(150 kDyne, 1 s dwell time).PBN was intrathecally injected into the damaged areas 30min after operation,then once a day for 7 days.The Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)Locomotor Rating Scale was used to assess the rats 3 days and 1 day before,and 1 day,5 days,10 days,15 days,20 days, 25 days,30 days and 35 days after SCI.NGF in the injured spinal cord tissue and serum was measured 1 h,12 h,24 h,48 h,3 days,7 days, 14 days and 21 days after SCI.ResultsNGF increased in serum but not in spinal cord.The ratio of NGF/total protein in serum rose and peaked 48 h after SCI,and the ratio was higher in NS group(0.92%±0.02%)than in PBN group(0.77%±0.05%)(P=0.021).BBB scores increased from the 9th day,and PBN group improved better than NS group(P＜0.01).ConclusionPBN could reduce the expression of NGF in the SCI rats,and promote the recovery of neurol function.

spinal cord injury;free radical;α-phenyl-N-tert-butylinitrone;nerve growth factor;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.08.002

R651.2

A

1006-9771(2014)08-0709-04

2013-07-17

2014-01-21)

1.廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.10151503102000008)；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院李嘉誠(chéng)科研基金資助項(xiàng)目(No.200906)。

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，廣東汕頭市515041。作者簡(jiǎn)介：劉少輝(1964-)，漢族，男，廣東河源市人，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事脊髓損傷修復(fù)基礎(chǔ)研究。通訊作者：徐錫金，男，醫(yī)學(xué)博士，教授。E-mail:xuxj@stu.edu.cn。

時(shí)間：2014-06-13 10:05

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3759.R.20140613.1005.002.html