劉蒙　趙龍鳳

【摘要】 目的：探討維生素D受體（VDR）FokⅠ基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者臨床表型的關聯(lián)。方法：應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）技術檢測VDR FokⅠ基因的多態(tài)性在44例慢性乙型肝炎重度患者、46例中度患者和40例非活動性HBsAg攜帶者中的分布，并進行基因型分析。結果：慢性乙型肝炎重度組、慢性乙型肝炎中度組VDR FokⅠ基因的基因型與對照組（非活動性HBsAg攜帶者）比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；慢性乙型肝炎重度組、中度組與對照組VDR FokⅠ基因酶切位點的等位基因F/f分布存差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。Pearson列聯(lián)系數(shù)=0.53，提示等位基因F/f分布與慢性乙型肝炎患者的不同臨床表型存在相關性。慢性乙型肝炎重度組、中度組f等位基因分布頻率高于對照組。結論：VDR FokⅠ基因的多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者的不同臨床表型存在一定的關系。

【關鍵詞】 慢性乙型肝炎； 維生素D受體； 基因多態(tài)性； 免疫調節(jié)

慢性乙型肝炎（CHB）是以肝細胞損傷和肝組織炎性反應為主的疾病，乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝損傷及轉歸與機體的細胞免疫密切相關，主要以T淋巴細胞清除病毒和肝細胞的損傷為主[1]。1，25-二羥維生素D3[1，25（OH）2D3]是維生素D3的活性形式[2]。隨著研究的深入，人們認識到它除了調節(jié)鈣磷代謝外，還具有介導免疫反應作用，而這些功能的實現(xiàn)主要是由維生素D受體（ vitamin D receptor， VDR）來介導的[3]。本研究采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）的方法，初步探討VDR基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者不同臨床表型的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月-11月本院感染科住院的慢性乙型肝炎現(xiàn)癥患者90例，其中重度患者44例，男26例，女18例，平均年齡（37.4±12.5）歲；中度患者46例，男29例，女17例，平均年齡（35.4±10.5）歲。對照組選擇同期本院感染科住院和門診的非活動性HBsAg攜帶者40例，其中男27例，女13例，平均年齡（32.5±9.2）歲，全部患者均為生活在本地區(qū)的漢族人群，無血緣關系。診斷標準參照“慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版”，所有患者在3個月內未使用免疫調節(jié)劑和抗病毒藥物，并排除合并其他病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化及肝癌等。全部患者均自愿參加本次研究。三組研究對象一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 實驗室檢查 肝功能相關指標，包括AST/ALT、血清總膽紅素TBIL、凝血酶原活動度PTA、血清白蛋白；檢測HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe和anti-HBc及HBV-DNA滴度。

1.2.2 基因組DNA的提取 留取慢性乙型肝炎中度及重度患者和非活動性HBsAg攜帶者空腹12 h后，晨起靜脈采血4 mL（EDTA抗凝），采用硅膠柱純化方式，用血液DNA提取試劑盒（D3741-01 美國OMEGA），從700 ?L抗凝血液中提取淋巴細胞基因組DNA。利用UV計測定所提取的DNA濃度及純度，并將其稀釋至10 ng/?L，分裝保存于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP） VDR FokⅠ基因的引物序列：上游引物，5，-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3；下游引物，5，-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3?？偡磻w系均為25 μL：1 ?L基因組DNA，2.5 ?L 10×PCR 緩沖液，上下游引物各0.5 μL，dNTPs 2 ?L，0.25 ?L Taq DNA 聚合酶，去離子水18.25 ?L。VDR FokⅠPCR擴增條件：95 ℃預變性4 min；98 ℃變性10 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。取擴增的PCR產物0.5 ?L，1 ?L限制性內切酶FokⅠ，及2 ?L 10×M Buffer， 2 ?L 0.1% BSA（由大連TaKaRa公司提供）及14.5 ?L滅菌水組成酶切總反應體系20 ?L，置于37 ℃水浴1 h，進行FokⅠ酶切，將酶切產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，以DL700 Marker為參考，紫外凝膠成像儀下觀察結果。

1.3 觀察指標 比較慢性乙型肝炎現(xiàn)癥患者重度組、中度組和對照組VDR基因多態(tài)性的差異；VDR FokⅠ基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎不同病情程度的關聯(lián)程度。

1.4 統(tǒng)計學處理 分別統(tǒng)計CHB現(xiàn)癥患者重度組、CHB現(xiàn)癥患者中度組和對照組非活動性HBsAg攜帶者基因型和等位基因的分布頻率數(shù)據(jù)，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，P>0.05認為資料可靠，代表性好。計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 擴增產物酶切結果電泳圖譜 VDR FokⅠ酶切后出現(xiàn)3種結果：純合子FF為270 bp，1條帶；雜合子Ff為270 bp、195 bp，2條帶；純合子ff為195 bp，1條帶，見圖1。

2.2 VDR FokⅠ基因的基因型和等位基因頻率分布 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗后，結果顯示符合Hardy-Weinberg平衡，說明資料可靠，代表性好。CHB重度組、中度組VDR FokⅠ基因的基因型與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=34.816，P<0.01）。見表1。CHB重度組、中度組患者與對照組VDR FokⅠ基因酶切位點的等位基因F/f分布差異有統(tǒng)計學意義（字2=50.674，P<0.01），Pearson列聯(lián)系數(shù)=0.53，提示等位基因F/f分布與慢性乙型肝炎患者的不同臨床表型存在相關性。CHB重度組、中度組f等位基因分布頻率高于對照組，見表1。

3 討論

VDR基因定位于12號染色體長臂，其包含有11個外顯子，在基因組上總長為75 Kb，VDR包含427個氨基酸殘基，分子量為50 KD[4]。目前報導的VDR基因多態(tài)性與4個單核苷酸多態(tài)性位點有關，分別為2號外顯子的FokⅠ位點、第8內含子的BsmⅠ位點、ApaⅠ位點及第9外顯子的TapⅠ位點。近年來，人們逐漸認識到VDR的基因多態(tài)性除了參與調節(jié)鈣磷代謝外，其有著更廣泛的生理作用，如：抗增殖、抗分化、調節(jié)細胞凋亡、介導免疫反應及多種內分泌腺激素的分泌，調節(jié)造血組織造血等作用[5-6]。

研究證明，Treg細胞和Th17細胞這兩種細胞亞型參與了免疫介導性肝炎的發(fā)病機制。Treg細胞為體內致免疫耐受的主要細胞，其有效控制病原體的T細胞反應，而Th17細胞主要通過產生細胞因子，如IL-17可促進炎癥反應，這兩種細胞亞型在特定的某些細胞因子等因素的作用下，可相互轉換，相互制約[7-9]。Sneha等[10]研究發(fā)現(xiàn)1，25-（OH）2D3可以通過阻礙IL-17轉錄因子活化T細胞核因子（NF-AT）復合體的形成，從而抑制IL-17的分泌，進而減輕Th17細胞介導的促炎癥反應。另有研究表明，1，25-（OH）2D3及其類似物通過作用于樹突狀細胞的nVDR，抑制了樹突狀細胞的成熟，使其處于未成熟狀態(tài)，因此其不能激活初始T細胞，進而使免疫反應不能繼續(xù)[11-12]。目前認為，不成熟樹突狀細胞可分泌TGF-b和/或IL-10來誘導初始T細胞向Treg細胞轉化，增加Treg細胞的水平，提高了機體的免疫耐受性[13-14]。

本實驗結果顯示，CHB重度組、中度組患者的f等位基因分布頻率高于對照組，提示等位基因f分布頻率的提高可能與CHB的炎癥再活動存在一定的關系。有研究表明，VDR基因FokⅠ多態(tài)性的C-T替換（F等位基因-f等位基因），造成潛在的起始位點，f等位基因編碼的VDR增加了3個氨基酸，f等位基因的轉錄效率比F等位基因降低了1.7倍，故ff基因型的個體，其VDR表達量較低，可能導致使ff基因型結合1，25-（OH）2D3的能力降低，進而使其介導的免疫耐受反應減弱，從而使慢乙肝患者所受的炎癥反應和免疫反應的傷害從一定程度上有所增強[15-16]。由此推測，等位基因f分布頻率的提高可能會促進慢性乙型肝炎患者炎癥的再活動。

VDR的基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎的病情發(fā)展程度有一定的關系，ff基因型的慢性乙型肝炎患者其炎癥再活動的可能性更大，且它極可能是通過影響個體的免疫功能而致病，這為更進一步實驗，了解慢性乙型肝炎的免疫發(fā)病機制及慢性乙型肝炎的基因治療提供了有價值的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2014-01-26） （本文編輯：黃新珍）

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（收稿日期：2014-01-26） （本文編輯：黃新珍）