郭紅霞 謝文劍 曹 藝 潘清平，▲

1.湖南省常德市第一人民醫(yī)院藥劑科，湖南常德 415000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208

RP-HPLC測定桑葉中綠原酸的含量

郭紅霞1謝文劍2曹 藝2潘清平1，2▲

1.湖南省常德市第一人民醫(yī)院藥劑科，湖南常德 415000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208

目的 建立反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定桑葉中活性成分綠原酸的方法。 方法 采用Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-1.0%醋酸水溶液，采用梯度洗脫，檢測波長為325 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積10 μl。 結(jié)果 綠原酸的線性范圍為0.3890～7.771 μg（r=0.9994），平均回收率為98.91%。 結(jié)論RP-HPLC檢測效率高，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可用于桑葉中綠原酸的定量測定，可作為該藥材的質(zhì)量控制方法之一。

桑葉；綠原酸；質(zhì)量控制；反相高效液相色譜法

桑葉為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的葉，初露后采收，除去雜質(zhì)，曬干，具有疏散風(fēng)熱，清肺潤燥，清肝明目之功效。主要用于風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭昏頭痛，目赤昏花[1]。現(xiàn)代藥理研究表明桑葉具有降血糖、降血壓、降血脂、抗炎、抗衰老、抗腫瘤等功效[2-4]。對(duì)桑葉的質(zhì)量控制研究大部分圍繞中桑葉中的活性成分蘆丁來進(jìn)行相應(yīng)的含量測定[5-6]，也有的圍繞黃酮類成分進(jìn)行相應(yīng)質(zhì)量控制研究[7]。目前，國內(nèi)外市場對(duì)桑葉的需求愈來愈大，且本課題組在前期指紋圖譜研究中發(fā)現(xiàn)綠原酸也是桑葉中的主要活性成分之一[8]，因此為了進(jìn)一步控制桑葉質(zhì)量，本研究采用反相高效液相色譜法（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）對(duì)從全國收集的桑葉藥材進(jìn)行綠原酸含量測定研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

KQ-100B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；BPZ11D型電子分析天平（Sartorius公司）；Waters2695-2996高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站，含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器（Waters公司）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純，TEDIA公司），乙腈（色譜純，TEDIA公司），水為哇哈哈純凈水，冰乙酸（色譜純，北京化工廠）。

1.3 對(duì)照品及樣品

對(duì)照品綠原酸購于中國藥品生物制品檢定所（供含量測定用，批號(hào)110753-200413），不同產(chǎn)地的桑葉藥材，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室潘清平教授鑒定為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：325 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10 μl；流動(dòng)相：乙腈（A）-1.0%醋酸水（B）梯度洗脫，洗脫程序：0→20 min，9%A→18%A。按照上述色譜條件，待測成分綠原酸分離很好，無干擾，得色譜圖1。

圖1 對(duì)照品綠原酸和樣品桑葉的RP-HPLC圖

2.2 供試品制備

取桑葉粉（80目）約1 g置50 ml三角瓶，精密稱定，加甲醇20 ml，稱重，超聲30 min（功率250 W，頻率40 kHz），取出，靜置，放涼，補(bǔ)重，0.22 μm微孔濾膜濾過，RP-HPLC分析。

2.3 對(duì)照品制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，用甲醇溶解，定容，得到濃度為0.3890 μg/μl的對(duì)照品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下的綠原酸對(duì)照品溶液1、3、5、8、10、15、20 μl進(jìn)樣分析，記錄按上述色譜條件測定的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣體積（μl）為橫坐標(biāo)（X），得綠原酸的線性回歸方程分別為：Y= 182 283X-131 274（r=0.9994，0.3890～7.771 μg）。

2.5 精密度

取同一供試品溶液，按上述RP-HPLC分析條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸峰面積，結(jié)果表明，峰面積RSD值＜0.65%。

2.6 重現(xiàn)性

一份固定粉末樣品，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行RP-HPLC分析，考察綠原酸峰面積，峰面積的RSD值＜1.02%，表明方法的重現(xiàn)性在誤差范圍內(nèi)。

2.7 穩(wěn)定性

制備藥材供試品溶液后，在室溫下放置不同時(shí)間，分別于0、1、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)行RP-HPLC分析，以綠原酸的峰面積計(jì)算，考察樣品的穩(wěn)定性，主要成分的峰面積在48 h內(nèi)RSD值＜1.24%，表明樣品至少在48 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.8 回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的桑葉藥材樣品約0.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量綠原酸對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)制成加樣供試品溶液，按上述色譜條件測定含量，計(jì)算回收率（表1）。從表1中可知，樣品的平均回收率為98.91%，RSD為0.84%，表明回收率符合要求。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 含量測定

按照上述色譜條件，將不同產(chǎn)地的樣品進(jìn)行處理和進(jìn)樣，每一個(gè)相同產(chǎn)地及批號(hào)的樣品測3份，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算桑葉中綠原酸的平均含量（表2）。從表2中可知，不同產(chǎn)地的桑葉藥材綠原酸含量均在0.25%以上，最高的可達(dá)0.90%，提示綠原酸確實(shí)為桑葉中的一個(gè)主要成分。

表2 桑葉藥材來源及其綠原酸含量的測定結(jié)果（n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)定量化合物為酚酸，在甲醇中有較好的溶解度，選擇甲醇超聲，處理容易、可控；且樣品呈酸性，選擇醋酸水溶液作為水相，水相中醋酸比例是通過單因素多水平試驗(yàn)確定最佳比例為1.0%。選擇乙腈作為有機(jī)相來分析中藥復(fù)方，柱壓穩(wěn)定且較低，有利于保護(hù)儀器和色譜柱。波長選擇325 nm也是基于所測化合物在該波長處吸收最大，且雜質(zhì)干擾較少。梯度選擇均一梯度變化以保證樣品具有更好的重復(fù)性。

含量測定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地桑葉活性成分綠原酸含量相差較大，中部地區(qū)河南、湖南產(chǎn)地的桑葉綠原酸含量較高。與目前藥典中收載的蘆丁含量相比，桑葉中綠原酸的含量均大于蘆丁，因此建議藥典桑葉標(biāo)準(zhǔn)中增加綠原酸含量測定。

在此次含量測定中，發(fā)現(xiàn)桑葉樣品還有其他幾個(gè)明顯的色譜峰，課題組下一步準(zhǔn)備分離制備這些色譜峰，進(jìn)行相應(yīng)結(jié)構(gòu)鑒定和富集，為下一步開展桑葉中主要成分含量測定及其活性測試奠定基礎(chǔ)。

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)系統(tǒng)工程[9]，本文僅對(duì)桑葉中綠原酸的含量進(jìn)行了測定，只是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)部分。其中，影響桑葉中綠原酸含量的因素很多，如產(chǎn)地、初加工、采收季節(jié)等，因此，只能把綠原酸作為評(píng)價(jià)桑葉質(zhì)量的指標(biāo)之一，應(yīng)該建立更為系統(tǒng)、全面、體現(xiàn)中藥特點(diǎn)的桑葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：279.

[2]羅存敏.桑葉提取物對(duì)小鼠血糖的影響及其有效成份測定[J].蠶業(yè)科學(xué)，2005，31（4）：418-421.

[3]陳建國，步文磊.桑葉多糖降糖作用及其機(jī)制研究[J].中草藥，2011，42（3）：515-520.

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[5]雷霖，何健飛.高效液相色譜法測定桑葉中蘆丁的含量[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（3）：468-469.

[6]周美環(huán)，趙書楷，陳淼，等.HPLC法測定桑葉中蘆丁的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（5）：228-229.

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[9]李貽奎，李連達(dá).從復(fù)方丹參制劑的混亂看中藥標(biāo)準(zhǔn)化的迫切性與必要性[J].中國中藥雜志，2008，33（4）：349-354.

Determination of chlorogenic acid in Molberry leaf by reverse phase high performance liquid chromatography

GUO Hong-xiao1XIE Wen-jian2CAO Yi2PAN Qing-ping1，2▲
1.Department of Pharmacy,the First People′s Hospital in Changde City of Hunan Province,Changde 415000,China; 2.College of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China

ObjectiveTo establish a method for determining chlorogenic acid,salviaflaside in Mulberry leaf by reverse phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC).MethodsThe separation was performed on a Kromasil-C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm)with gradient elution using acetonitrile-1.0%acetic acid as mobile phase.The detection wavelength was 325 nm and the column temperature was 30℃with the flow rate of 1.0 ml/min,the sample injection was 10 μl.ResultsLinear ranges of chlorogenic acid was 0.3890-7.771 μg(r=0.9994),respectively.Its average recoveries was 98.91%.ConclusionThe RP-HPLC method established in this experiment can be used to determine the contents of chlorogenic acid in Mulberry leaf.The method can also be used as the standard for the quality control of Mulberry leaf because of simplicity,reliability and accuracy.

Mulberry leaf;Chlorogenic acid;Quality control;Reverse phase high performance liquid chromatography

R286.0

A

1674-4721（2014）02（a）-0017-03

2013-12-03本文編輯：郭靜娟）

▲通訊作者：潘清平，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庤b定與質(zhì)量控制