鄭悅康 葉志英 劉綺明

廣東省中山市疾病預(yù)防控制中心，廣東中山 528400

應(yīng)用微生物法試劑盒檢測(cè)奶粉中維生素B6的含量

鄭悅康 葉志英 劉綺明

廣東省中山市疾病預(yù)防控制中心，廣東中山 528400

目的 建立應(yīng)用微生物法試劑盒檢測(cè)奶粉中維生素B6含量的分析方法。 方法 采用維生素B6微生物檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)奶粉中添加維生素B6的含量。 結(jié)果 維生素B6的線性范圍為0.002～0.012 mg/100 g（ml），檢出限為0.002 mg/100 g（ml），其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9987，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%，其回收率達(dá)到90.0%～108%。 結(jié)論 微生物法試劑盒具有靈敏度高，檢出限低，線性范圍寬，操作方法簡(jiǎn)便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于奶粉中維生素B6的檢測(cè)工作。

維生素B6；吡哆醇；微生物法

維生素B6是所有呈現(xiàn)吡哆醛生物活性的3-羥基-2-甲基吡啶衍生物的總稱，主要是吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇，在自然界廣泛分布，其磷酸化形式是氨基酸代謝過(guò)程的輔酶，如轉(zhuǎn)氨酶的輔酶。加入食品中的維生素B6通常為鹽酸吡哆醇或5-磷酸吡哆醇形式，5-磷酸吡哆醇也以維生素B6衍生物的形式天然存在于食品中。主要臨床應(yīng)用有：維生素B6缺乏癥、嬰兒驚厥、血紅蛋白缺陷所致的貧血、放射病及某些抗癌藥物引起的惡心、嘔吐或妊娠嘔吐的治療[1]。據(jù)報(bào)道每天補(bǔ)充40 mg維生素B6可以防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。研究表明，當(dāng)維生素B6達(dá)到一定血藥濃度時(shí)，還可以與血小板表面蛋白質(zhì)、纖維蛋白原及凝血酶原等凝血物質(zhì)結(jié)合，從而阻止血小板聚集，防止血液凝固，延長(zhǎng)凝血時(shí)間，使血栓不易形成，因而具有預(yù)防腦血栓的藥理作用[2]。目前，市場(chǎng)上出售的奶粉成分中一般都含有維生素B6，特別在嬰幼兒配方奶粉中是必需添加的一種維生素。測(cè)定食品中維生素B6的方法有化學(xué)法和生物法，化學(xué)法主要是儀器分析如液相色譜法[3-4]、氣相色譜法[5]、熒光光度法[6-7]、紫外分光光度法[8-9]等。生物法也叫微生物法，其優(yōu)勢(shì)則在于：①它是以應(yīng)用微生物試驗(yàn)對(duì)象為基礎(chǔ)，測(cè)的是生物活性含量，更具生物學(xué)意義；②微生物作為一種活試劑，具有自身的特異性和高度的靈敏性，使測(cè)定結(jié)果較化學(xué)方法更為準(zhǔn)確?；谶@些原因，GB/T5009.154-2003將微生物法規(guī)定為測(cè)定食品中維生素B6的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[10-11]。

本次研究所用的試劑盒利用微生物法的原理，將維生素B6檢測(cè)培養(yǎng)基和稀釋后的樣品提取液加入包被有釀酒酵母的微孔中。釀酒酵母的生長(zhǎng)離不開維生素B6，加入維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品或含維生素B6的樣品后，釀酒酵母開始生長(zhǎng)直至維生素被完全消耗。30℃避光44～48 h完全孵育。釀酒酵母的代謝或生長(zhǎng)強(qiáng)度與提取液中維生素B6的含量有關(guān)，可通過(guò)在610～630 nm 或540～550 nm下采用酶標(biāo)儀讀取溶液混濁度獲得，將樣品濁度與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比即可得到樣品中維生素B6含量。

1 材料與方法

1.1 儀器

Sunrise酶標(biāo)儀（奧地利TECAN）、電子分析天平（上海梅特勒）、離心機(jī)（上海安亭）、恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)BINDER）。

1.2 試劑

VitaFast維生素B6（吡哆醇）檢測(cè)試劑盒（北京博歐實(shí)德生物技術(shù)有限公司提供）；鹽酸吡哆醇（維生素B6）純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.7%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院生產(chǎn)）；酸性馬鈴薯磷酸酶（美國(guó)Sigma生產(chǎn)）；枸櫞酸鹽緩沖液（pH4.5）：將1.5 g枸櫞酸一水化合物加入100 ml燒杯中，加入50 ml無(wú)菌水，邊攪拌邊溶解，然后加入12 ml NaOH（1 mol/L），用0.1 mol/L HCl將pH調(diào)至4.5，將溶液定量轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，用無(wú)菌水定容；實(shí)驗(yàn)用水均為滅菌超純水；樣品均為市售奶粉。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 準(zhǔn)確稱取鹽酸吡哆醇（維生素B6）純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.050 g，用枸櫞酸鹽緩沖液溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，配成50 mg/100 ml溶液，置于冰箱中保存以備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液 在測(cè)定時(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液按比例用枸櫞酸鹽緩沖液準(zhǔn)確稀釋成濃度為10 mg/100 ml、25 mg/100 ml。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1 g均質(zhì)后的樣品，將其加入50 ml無(wú)菌離心管中，加入20 ml枸櫞酸鹽緩沖液，振蕩混勻，加入10 mg酸性馬鈴薯磷酸酶，振蕩混勻，37℃避光孵育1 h，同時(shí)間歇性振蕩，用無(wú)菌水補(bǔ)至40 ml。振蕩混勻后，在95℃水浴中提取30 min，期間應(yīng)至少混合5次，然后快速冷卻至30℃以下，在＞8000 g下離心5 min。根據(jù)維生素B6的濃度范圍，在1.5 ml無(wú)菌離心管中應(yīng)用無(wú)菌水對(duì)上清液進(jìn)一步稀釋成100倍或以上，使測(cè)定OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

1.5 檢測(cè)步驟

取出所需數(shù)量的微孔板條并在板上固定，依次將150 μl維生素B6檢測(cè)培養(yǎng)基、150 μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品稀釋液加入微孔中，用黏合箔蓋住微孔條或微孔。在30℃培養(yǎng)箱中避光孵育44～48 h。再次向下擠壓黏合箔，將微孔板向上放置在桌面上，在桌面平面上振蕩，使微生物溶解在培養(yǎng)基中。小心揭開黏合箔，用移液槍頭破壞微孔液體表面所有的泡沫。用酶標(biāo)儀在620 nm條件下測(cè)量渾濁度。

1.6 結(jié)果計(jì)算

應(yīng)用4參數(shù)法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。4參數(shù)法是指用含有4個(gè)參數(shù)的方程表示因變量（Y）隨自變量（X）變化的規(guī)律。目前最常用于免疫檢測(cè)領(lǐng)域，用于描述吸光度隨抗原濃度變化的規(guī)律，四參數(shù)模式為Y=D+（A-D）/ [1+（X/C）^B]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取維生素B6的標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液（試劑盒自帶）按比例稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0.002、0.004、 0.006、0.008、0.012 mg/100 g。以標(biāo)準(zhǔn)系列中的維生素B6濃度為橫坐標(biāo)，酶標(biāo)儀的測(cè)量OD值為縱坐標(biāo)繪制維生素B6的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。4參數(shù)曲線法線性回歸方程為Y=-0.012 763 0+（1.530 362 86+0.012 276 30）/ [1+（X/0.006 597 79）^（-1.455 190 92）]，其相關(guān)系數(shù)為0.9987。

圖1 維生素B6的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的精密度分析

將進(jìn)行樣品處理的4種不同的奶粉樣品分別進(jìn)行6次維生素B6測(cè)定，得出不同樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值（表1）。

表1 精密度分析（n=6）

2.3 方法的加標(biāo)回收率

將兩種不同的奶粉樣品，分別加入質(zhì)量濃度為10、25、50 mg/100 ml的維生素B6標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μl，再按樣品處理的步驟進(jìn)行處理，然后平行測(cè)定6次，得到不同樣品的加標(biāo)回收率（表2）。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=6）

3 討論

由于維生素B6是水溶性維生素，在高溫、光線直射、空氣暴露等環(huán)境條件下，會(huì)部分降解損失，故在樣品提取操作過(guò)程中，要盡可能在避光條件下操作，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在冷藏、避光條件下保存并盡快分析。含樣品的微孔板在30℃培養(yǎng)箱中避光孵育后，將其放于2～8℃冰箱保存，分別于24、48、72 h取微孔板用酶標(biāo)儀在620 nm條件下測(cè)量渾濁度，結(jié)果顯示48 h內(nèi)微孔板中的維生素B6性質(zhì)穩(wěn)定。

加入微孔中的樣品提取液，樣品稀釋液用水，以及實(shí)驗(yàn)中需要的其他耗材都必須無(wú)菌。樣品無(wú)菌提取后，也必須在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行操作。要保證黏合膜和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分，防止樣品液在振蕩過(guò)程中相互混合影響測(cè)量結(jié)果。檢測(cè)樣品前要估算樣品中維生素B6的含量進(jìn)行稀釋，稀釋過(guò)程要準(zhǔn)確，樣品的測(cè)量OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中部的結(jié)果可信度較高。

微生物法測(cè)定維生素B6的含量近50年來(lái)雖然已被廣泛地納入各類國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法中，但在我國(guó)應(yīng)用卻很少。微生物法操作繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，與目前分析方法簡(jiǎn)便、快速、高效的發(fā)展方向所不符[12]。因此，微生物檢測(cè)試劑盒通過(guò)優(yōu)化樣品處理、試劑配制、反應(yīng)條件，省略了菌種保存及種子培養(yǎng)液的制備[13]，能有效地簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的各種干擾，從而達(dá)到節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間、減輕工作量，進(jìn)而得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果的目的，同時(shí)該方法檢出限、線性關(guān)系、精密度、加標(biāo)回收率、穩(wěn)定性等技術(shù)參數(shù)能滿足奶粉中維生素B6的微量分析的要求，表明該方法可用于測(cè)定奶粉中維生素B6的含量，結(jié)果令人滿意。

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The measurement of vitamin B6in milk powder by microbiological method

ZHENG Yue-kang YE Zhi-ying LIU Qi-ming
Zhongshan Center for Disease Control and Prevention in Guangdong Province,Zhongshan 528400,China

ObjectiveTo develop a method of measuring vitamin B6in milk powder by microbiological method.MethodsVitamin B6in the samples of milk powder was measured by vitamin B6quantitative microbial detection kit.ResultsThe standard curve of vitamin B6was linear in the range of 0.002-0.012 mg/100 g (ml)(r=0.9987),and the detection limit was 0.002 mg/100 g (ml).The relative standard deviations of different samples were all below 10%and the recoveries were between 90.0%and 108%.ConclusionMicrobiological method is convenient,rapid and accurate.It can be used to develop a high sensitivity and low detection limit method to measure vitamin B6in milk powder.

Vitamin B6;Pyridoxine;Microbiological method

R155.5

A

1674-4721（2014）02（a）-0012-03

2013-12-02本文編輯：郭靜娟）

鄭悅康（1979-），男，本科，主管技師，主要從事食品微生物檢驗(yàn)工作