鄭悅康 葉志英 劉綺明

廣東省中山市疾病預(yù)防控制中心，廣東中山 528400

應(yīng)用微生物法試劑盒檢測奶粉中維生素B6的含量

鄭悅康 葉志英 劉綺明

廣東省中山市疾病預(yù)防控制中心，廣東中山 528400

目的 建立應(yīng)用微生物法試劑盒檢測奶粉中維生素B6含量的分析方法。 方法 采用維生素B6微生物檢測試劑盒定量檢測奶粉中添加維生素B6的含量。 結(jié)果 維生素B6的線性范圍為0.002～0.012 mg/100 g（ml），檢出限為0.002 mg/100 g（ml），其標準曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9987，相對標準偏差均<10%，其回收率達到90.0%～108%。 結(jié)論 微生物法試劑盒具有靈敏度高，檢出限低，線性范圍寬，操作方法簡便、快捷，結(jié)果準確可靠等優(yōu)點，可用于奶粉中維生素B6的檢測工作。

維生素B6；吡哆醇；微生物法

維生素B6是所有呈現(xiàn)吡哆醛生物活性的3-羥基-2-甲基吡啶衍生物的總稱，主要是吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇，在自然界廣泛分布，其磷酸化形式是氨基酸代謝過程的輔酶，如轉(zhuǎn)氨酶的輔酶。加入食品中的維生素B6通常為鹽酸吡哆醇或5-磷酸吡哆醇形式，5-磷酸吡哆醇也以維生素B6衍生物的形式天然存在于食品中。主要臨床應(yīng)用有：維生素B6缺乏癥、嬰兒驚厥、血紅蛋白缺陷所致的貧血、放射病及某些抗癌藥物引起的惡心、嘔吐或妊娠嘔吐的治療[1]。據(jù)報道每天補充40 mg維生素B6可以防止動脈粥樣硬化的發(fā)展。研究表明，當維生素B6達到一定血藥濃度時，還可以與血小板表面蛋白質(zhì)、纖維蛋白原及凝血酶原等凝血物質(zhì)結(jié)合，從而阻止血小板聚集，防止血液凝固，延長凝血時間，使血栓不易形成，因而具有預(yù)防腦血栓的藥理作用[2]。目前，市場上出售的奶粉成分中一般都含有維生素B6，特別在嬰幼兒配方奶粉中是必需添加的一種維生素。測定食品中維生素B6的方法有化學法和生物法，化學法主要是儀器分析如液相色譜法[3-4]、氣相色譜法[5]、熒光光度法[6-7]、紫外分光光度法[8-9]等。生物法也叫微生物法，其優(yōu)勢則在于：①它是以應(yīng)用微生物試驗對象為基礎(chǔ)，測的是生物活性含量，更具生物學意義；②微生物作為一種活試劑，具有自身的特異性和高度的靈敏性，使測定結(jié)果較化學方法更為準確?；谶@些原因，GB/T5009.154-2003將微生物法規(guī)定為測定食品中維生素B6的國家標準方法[10-11]。

本次研究所用的試劑盒利用微生物法的原理，將維生素B6檢測培養(yǎng)基和稀釋后的樣品提取液加入包被有釀酒酵母的微孔中。釀酒酵母的生長離不開維生素B6，加入維生素B6標準品或含維生素B6的樣品后，釀酒酵母開始生長直至維生素被完全消耗。30℃避光44～48 h完全孵育。釀酒酵母的代謝或生長強度與提取液中維生素B6的含量有關(guān)，可通過在610～630 nm 或540～550 nm下采用酶標儀讀取溶液混濁度獲得，將樣品濁度與標準曲線對比即可得到樣品中維生素B6含量。

1 材料與方法

1.1 儀器

Sunrise酶標儀（奧地利TECAN）、電子分析天平（上海梅特勒）、離心機（上海安亭）、恒溫培養(yǎng)箱（德國BINDER）。

1.2 試劑

VitaFast維生素B6（吡哆醇）檢測試劑盒（北京博歐實德生物技術(shù)有限公司提供）；鹽酸吡哆醇（維生素B6）純度標準物質(zhì)（純度99.7%，中國計量科學研究院生產(chǎn)）；酸性馬鈴薯磷酸酶（美國Sigma生產(chǎn)）；枸櫞酸鹽緩沖液（pH4.5）：將1.5 g枸櫞酸一水化合物加入100 ml燒杯中，加入50 ml無菌水，邊攪拌邊溶解，然后加入12 ml NaOH（1 mol/L），用0.1 mol/L HCl將pH調(diào)至4.5，將溶液定量轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，用無菌水定容；實驗用水均為滅菌超純水；樣品均為市售奶粉。

1.3 標準樣品的制備

1.3.1 標準儲備液 準確稱取鹽酸吡哆醇（維生素B6）純度標準物質(zhì)0.050 g，用枸櫞酸鹽緩沖液溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，配成50 mg/100 ml溶液，置于冰箱中保存以備用。

1.3.2 標準工作液 在測定時，將標準儲備液按比例用枸櫞酸鹽緩沖液準確稀釋成濃度為10 mg/100 ml、25 mg/100 ml。

1.4 樣品處理

準確稱取1 g均質(zhì)后的樣品，將其加入50 ml無菌離心管中，加入20 ml枸櫞酸鹽緩沖液，振蕩混勻，加入10 mg酸性馬鈴薯磷酸酶，振蕩混勻，37℃避光孵育1 h，同時間歇性振蕩，用無菌水補至40 ml。振蕩混勻后，在95℃水浴中提取30 min，期間應(yīng)至少混合5次，然后快速冷卻至30℃以下，在＞8000 g下離心5 min。根據(jù)維生素B6的濃度范圍，在1.5 ml無菌離心管中應(yīng)用無菌水對上清液進一步稀釋成100倍或以上，使測定OD值在標準曲線范圍內(nèi)。

1.5 檢測步驟

取出所需數(shù)量的微孔板條并在板上固定，依次將150 μl維生素B6檢測培養(yǎng)基、150 μl標準品或樣品稀釋液加入微孔中，用黏合箔蓋住微孔條或微孔。在30℃培養(yǎng)箱中避光孵育44～48 h。再次向下擠壓黏合箔，將微孔板向上放置在桌面上，在桌面平面上振蕩，使微生物溶解在培養(yǎng)基中。小心揭開黏合箔，用移液槍頭破壞微孔液體表面所有的泡沫。用酶標儀在620 nm條件下測量渾濁度。

1.6 結(jié)果計算

應(yīng)用4參數(shù)法進行結(jié)果計算。4參數(shù)法是指用含有4個參數(shù)的方程表示因變量（Y）隨自變量（X）變化的規(guī)律。目前最常用于免疫檢測領(lǐng)域，用于描述吸光度隨抗原濃度變化的規(guī)律，四參數(shù)模式為Y=D+（A-D）/ [1+（X/C）^B]。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線的繪制

分別移取維生素B6的標準品濃縮液（試劑盒自帶）按比例稀釋成標準系列濃度分別為0.002、0.004、 0.006、0.008、0.012 mg/100 g。以標準系列中的維生素B6濃度為橫坐標，酶標儀的測量OD值為縱坐標繪制維生素B6的標準曲線（圖1）。4參數(shù)曲線法線性回歸方程為Y=-0.012 763 0+（1.530 362 86+0.012 276 30）/ [1+（X/0.006 597 79）^（-1.455 190 92）]，其相關(guān)系數(shù)為0.9987。

圖1 維生素B6的標準曲線

2.2 方法的精密度分析

將進行樣品處理的4種不同的奶粉樣品分別進行6次維生素B6測定，得出不同樣品的相對標準偏差（RSD）值（表1）。

表1 精密度分析（n=6）

2.3 方法的加標回收率

將兩種不同的奶粉樣品，分別加入質(zhì)量濃度為10、25、50 mg/100 ml的維生素B6標準溶液各10 μl，再按樣品處理的步驟進行處理，然后平行測定6次，得到不同樣品的加標回收率（表2）。

表2 加標回收試驗（n=6）

3 討論

由于維生素B6是水溶性維生素，在高溫、光線直射、空氣暴露等環(huán)境條件下，會部分降解損失，故在樣品提取操作過程中，要盡可能在避光條件下操作，標準溶液應(yīng)在冷藏、避光條件下保存并盡快分析。含樣品的微孔板在30℃培養(yǎng)箱中避光孵育后，將其放于2～8℃冰箱保存，分別于24、48、72 h取微孔板用酶標儀在620 nm條件下測量渾濁度，結(jié)果顯示48 h內(nèi)微孔板中的維生素B6性質(zhì)穩(wěn)定。

加入微孔中的樣品提取液，樣品稀釋液用水，以及實驗中需要的其他耗材都必須無菌。樣品無菌提取后，也必須在無菌環(huán)境中進行操作。要保證黏合膜和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分，防止樣品液在振蕩過程中相互混合影響測量結(jié)果。檢測樣品前要估算樣品中維生素B6的含量進行稀釋，稀釋過程要準確，樣品的測量OD值在標準曲線中部的結(jié)果可信度較高。

微生物法測定維生素B6的含量近50年來雖然已被廣泛地納入各類國際標準方法中，但在我國應(yīng)用卻很少。微生物法操作繁瑣、實驗周期長，與目前分析方法簡便、快速、高效的發(fā)展方向所不符[12]。因此，微生物檢測試劑盒通過優(yōu)化樣品處理、試劑配制、反應(yīng)條件，省略了菌種保存及種子培養(yǎng)液的制備[13]，能有效地簡化實驗步驟，排除實驗過程中的各種干擾，從而達到節(jié)省實驗時間、減輕工作量，進而得到準確的定量結(jié)果的目的，同時該方法檢出限、線性關(guān)系、精密度、加標回收率、穩(wěn)定性等技術(shù)參數(shù)能滿足奶粉中維生素B6的微量分析的要求，表明該方法可用于測定奶粉中維生素B6的含量，結(jié)果令人滿意。

[1]陳汝杰.維生素B6臨床應(yīng)用新進展[J].中國臨床醫(yī)生，2010，38（11）：26-27.

[2]陳偉，王穎.維生素B6的新途徑[J].人民軍醫(yī)，1994，13 （9）：69-70.

[3]GB5413-2010.嬰幼兒食品和乳品中維生素B6的測定[S].

[4]宋萍萍，曹江平，劉書慧.反相高效液相色譜法測定果醋中的8種維生素[J].食品科學，2012，33（12）：181-184.

[5]陳鳳恩，趙文超，汪帆.維生素B6中間體的氣相色譜分析[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2002，33（5）：241-242.

[6]謝秀娟，張振新.離子液體雙水相萃取熒光法測定維生素B6[J].分析科學學報，2011，27（4）：513-515.

[7]徐燁，顧鑫榮，張秀娟，等.同步熒光法測定功能飲料中維生素B2和B6的研究[J].分析試驗室，2008，27（7）：85-97.

[8]曹高娃，崔毅，張力.紫外分光光度法測定維生素B6[J].光譜實驗室，2001，18（6）：802-803.

[9]陳恕華.紫外分光光度法測定維生素B6[J].理化檢驗：化學分冊，2005（7）：519，521.

[10]GB/T5009.154-2003.食品中維生素B6的測定[S].

[11]王為黎，馬景宏，張旭，張志宏.運用微生物法測定保健食品中的維生素B6[J].中國微生態(tài)學雜志，2006，18（4）：291-295.

[12]張旭，李援，胡英.微生物分析方法測定保健食品中維生素B6的含量[J].中國微生態(tài)學雜志，2005，17（6）：477-478.

[13]陳亞波，周敏，楊彤.微生物法測定維生素飲料中的維生素B6[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41（12）：5502-5503，5509.

The measurement of vitamin B6in milk powder by microbiological method

ZHENG Yue-kang YE Zhi-ying LIU Qi-ming
Zhongshan Center for Disease Control and Prevention in Guangdong Province,Zhongshan 528400,China

ObjectiveTo develop a method of measuring vitamin B6in milk powder by microbiological method.MethodsVitamin B6in the samples of milk powder was measured by vitamin B6quantitative microbial detection kit.ResultsThe standard curve of vitamin B6was linear in the range of 0.002-0.012 mg/100 g (ml)(r=0.9987),and the detection limit was 0.002 mg/100 g (ml).The relative standard deviations of different samples were all below 10%and the recoveries were between 90.0%and 108%.ConclusionMicrobiological method is convenient,rapid and accurate.It can be used to develop a high sensitivity and low detection limit method to measure vitamin B6in milk powder.

Vitamin B6;Pyridoxine;Microbiological method

R155.5

A

1674-4721（2014）02（a）-0012-03

2013-12-02本文編輯：郭靜娟）

鄭悅康（1979-），男，本科，主管技師，主要從事食品微生物檢驗工作