林秀仙 羅愛勤 陳 亮

廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司 中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心，廣州 510240

桑葉總黃酮不同純化工藝的比較

林秀仙 羅愛勤 陳 亮

廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司 中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心，廣州 510240

目的 比較桑葉總黃酮不同的純化工藝，為找到一種總黃酮含量＞15%，簡便可行，廉價且適于生產(chǎn)的純化工藝。 方法 采用D101型、AB-8型和JD-1型大孔吸附樹脂吸附法，乙酸乙酯萃取法，醇提水沉法，醇提-水沉-醇沉法6種方法對桑葉總黃酮進(jìn)行純化，以總黃酮的收率和含量為考察指標(biāo)進(jìn)行評價。 結(jié)果6種方法制備的總黃酮的百分含量依次為：50.3%、48.5%、55.7%、82.1%、10.8%、18.5%，產(chǎn)品收率依次為：2.37%、2.42%、2.28%、0.45%、18.21%、15.93%。 結(jié)論 采用醇提-水沉-醇沉法即可得到符合要求的桑葉總黃酮。

桑葉；總黃酮；純化工藝

桑葉為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥葉，味甘、苦，性寒，歸肺、肝經(jīng)；具有疏散風(fēng)熱，清肺潤燥，清肝明目的功效；用于風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭昏頭痛，目赤昏花等癥[1]。桑葉的生物活性物質(zhì)主要有黃酮類化合物、生物堿、多糖、桑葉蛋白等[2]，其中黃酮類化合物含有桑色素、蕓香苷、槲皮素、異槲皮素、紫云英苷等，含量占干葉重的1.0%～3.0%，是植物中莖葉黃酮類化合物含量較高的一種[3]。黃酮類化合物作為桑葉的重要活性成分之一，具有抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖、防止動脈硬化和抗衰老等功效[4]。桑葉中總黃酮類化合物的常用提取方法是：以濃度約為70%的乙醇為提取溶劑，用浸漬法、超聲波法或加熱回流法等進(jìn)行提取[3-7]。本實驗以70%乙醇為溶劑，加熱回流提取桑葉后，分別考察了不同的純化工藝，并以總黃酮為考察指標(biāo)，制備含量達(dá)15%以上的桑葉總黃酮，為桑葉總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

桑葉（廣東廣弘藥材有限公司，20130701），蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，100080-200707），D101型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂、JD-1型大孔樹脂（凈品型，天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂分公司），95%乙醇（醫(yī)用級），水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申科機械研究所），YZG-1000A型真空干燥機（常州市范群干燥設(shè)備有限公司），BS210S型電子天平（德國賽多利斯），UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司），層析柱（直徑2.5 cm×50 cm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 桑葉總黃酮的純化方法

2.1.1 桑葉總黃酮的提取 稱取桑葉1 kg，加入10倍量70%乙醇，加熱回流提取2次，1.5 h/次，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至無乙醇?xì)馕叮铀♂屩?0 L，備用。

2.1.2 D101型樹脂吸附法 稱取已處理好的D101型樹脂50 g，用濕法裝柱法裝入層析柱（直徑2.5 cm×50 cm）中。將“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，加入樹脂柱內(nèi)，控制流速為2～4 ml/min。當(dāng)溶液全部吸附后，用蒸餾水（3 ml/min）洗脫至流出液無色。再用70%乙醇400 ml洗脫，洗脫速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥，干燥物稱重，并用紫外分光光度法測固體物中的總黃酮含量[8-10]。

2.1.3 AB-8型樹脂吸附法 稱取已處理好的AB-8型樹脂50 g，用濕法裝柱法裝入層析柱（直徑2.5 cm×50 cm）中。將“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，加入樹脂柱內(nèi)，控制流速為2～4 ml/min。當(dāng)溶液全部吸附后，用蒸餾水（3 ml/min）洗脫至流出液無色。再用70%乙醇400 ml洗脫，洗脫速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥，干燥物稱重，并用紫外分光光度法測固體物中的總黃酮含量。

2.1.4 JD-1型樹脂吸附法 稱取已處理好的JD-1型樹脂50 g，用濕法裝柱法裝入層析柱（直徑2.5 cm×50 cm）中。將“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，加入樹脂柱內(nèi)，控制流速為2～4 ml/min。當(dāng)溶液全部吸附后，用蒸餾水（3 ml/min）洗脫至流出液無色。再用70%乙醇400 ml洗脫，洗脫速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥，干燥物稱重，并用紫外分光光度法測固體物中的總黃酮含量。

2.1.5 乙酸乙酯萃取法 取 “2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，減壓濃縮成100 ml，置250 ml分液漏斗中，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次用100 ml。合并3次萃取的乙酸乙酯，減壓濃縮，轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿中，在水浴上將乙酸乙酯揮干，然后真空干燥，得干膏，稱重，并用紫外分光光度法測總黃酮的含量。

2.1.6 醇提水沉法 取“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，于4℃冰箱中放置12 h后，取出，濾過，取濾液減壓濃縮，真空干燥，得干膏，稱重，并用紫外分光光度法測總黃酮的含量。

2.1.7 醇提-水沉-醇沉法 取“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，于4℃冰箱中放置12 h后，取出，濾過，取濾液減壓濃縮至25 ml，加乙醇使含醇量達(dá)70%，攪拌1 min，再于4℃冰箱中放置12 h后，取出，濾過，取濾液減壓濃縮，真空干燥，得干膏，稱重，并用紫外分光光度法測總黃酮的含量。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品6.33 mg，加乙醇制成每毫升含蘆丁0.2532 mg的溶液，即得。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液0.5、 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分別置25 ml量瓶中，各加水至6 ml，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，使混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，應(yīng)用紫外-可見分光光度法，500 nm波長測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[1]。

結(jié)果表明，蘆丁對照品在質(zhì)量為0.1266～1.5192 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（表1），得回歸方程為Y= 0.3943X+0.0195，r=0.9999。

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.3 樣品含量測定結(jié)果 稱取各工藝制備的桑葉總黃酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇適量，超聲處理30 min，冷卻后加稀乙醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加水至6 ml”起，依法測定吸光度，同時精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為空白溶液。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的量，計算，即得（表2）。

表2 不同純化工藝制備的總黃酮收率和含量測定結(jié)果

2.2.4 準(zhǔn)確度試驗 采用加樣回收法，取醇提-水沉-醇沉法所得樣品（含總黃酮18.5%），稱量6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入蘆丁對照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，分別按“2.2.3”方法操作，測定每份總黃酮含量（表3）。結(jié)果表明，回收率均在95%～105%內(nèi)，RSD= 2.34%（<3%），符合方法學(xué)要求。

表3 準(zhǔn)確度試驗的結(jié)果

3 討論

從不同純化工藝制備的桑葉總黃酮含量的測定結(jié)果分析，乙酸乙酯萃取法的純化效果較好，總黃酮含量最高，但是收率太低，說明大部分黃酮類化合物沒被保留下來，這樣的工藝和結(jié)果在實際生產(chǎn)上不可??；大孔樹脂吸附法的總黃酮含量也較高，尤其是D101型和JD-1型大孔樹脂，可以使總黃酮含量達(dá)50%以上，但是收率較低，且生產(chǎn)工藝復(fù)雜，操作繁瑣，不符合工藝簡便廉價的要求；醇提-水沉-醇沉法，總黃酮含量符合15%以上的要求，收率高，工藝廉價簡便，因此更適于實際生產(chǎn)。

此外，本試驗還為生產(chǎn)上制備各種含量的桑葉總黃酮提供了一個參考，根據(jù)總黃酮的含量需求可選擇相應(yīng)的純化工藝。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：279，372-373.

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Comparative studies on different methods of purification of total flavones from Mulberry leaf

LIN Xiu-xian LUO Ai-qin CHEN Liang
Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co,Ltd.National Engineer Research Center for the Modernization of Extraction and Separation of TCM,Guangdong Province,Guangzhou 510240,China

ObjectiveTo compare the purification effects of different purification techniques of total flavones from Mulberry leaf.In order to find a purification technology which is cheap,simple,feasible and suitable for the production of total flavones whose purity is more than 15%.MethodsSix purifying methods,including adsorption with macroreticular adsorption resin D101,AB-8,JD-1,extraction with ethylacetate,alcohol sedimentation method,alcohol sedimentation and alcohol precipitation method,were adopted,and the amound and purity of total flavones collected were compared.ResultsBy using the above-mentioned six methods,the percentages of the contents of total flavones was 50.3%,48.5%,55.7%,82.1%, 10.8%and 18.5%respectively,the recoveries of products was 2.37%,2.42%,2.28%,0.45%,18.21%and 15.93%respectively.ConclusionUsing the alcohol sedimentation and alcohol precipitation method can get total flavones up to requirement.

Mulberry leaf;Total flavones;Purification techniques

R284

A

1674-4721（2014）02（a）-0010-03

2013-11-13本文編輯：郭靜娟）

廣東省科技計劃項目（2009A030901008）

林秀仙（1967-），女，制藥高級工程師，主要從事中藥產(chǎn)業(yè)化及生產(chǎn)管理與在產(chǎn)品種技改工作