林建明 周 潔 楊 霞 達(dá)靜靜 何平紅 易 韋 查 艷▲

1.貴州省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴陽(yáng) 550002；2.貴州省興義市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州興義 562400；3.貴州省人民醫(yī)院病理科，貴陽(yáng) 550002

1，25-（OH）2-D3對(duì)進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)膠原蛋白Ⅲ表達(dá)的影響

林建明1★周 潔2★楊 霞1達(dá)靜靜1何平紅1易 韋3查 艷1▲

1.貴州省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴陽(yáng) 550002；2.貴州省興義市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州興義 562400；3.貴州省人民醫(yī)院病理科，貴陽(yáng) 550002

目的 探討1，25-（OH）2-D3對(duì)進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)膠原蛋白Ⅲ（ColⅢ）表達(dá)的影響。 方法 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（n=7）：假手術(shù)組（對(duì)照組）、進(jìn)展性腎炎組（模型組）、6 ng/（100 g·d）1，25-（OH）2-D3干預(yù)組（治療組）。除對(duì)照組外，其余組均采用右腎切除并2次注射IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1單克隆抗體，制備進(jìn)展性腎炎大鼠模型。1，25-（OH）2-D3干預(yù)8周后，檢測(cè)各組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及電解質(zhì)的變化，Masson染色觀(guān)察腎組織病理改變。免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎小管間質(zhì)ColⅢ的表達(dá)。 結(jié)果 與模型組比較，1，25-（OH）2-D3治療不僅使大鼠24 h尿蛋白及BUN均明顯降低（P＜0.05），還能使ColⅢ表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。腎組織病理?yè)p害明顯減輕。 結(jié)論 1，25-（OH）2-D3可能通過(guò)明顯降低進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)ColⅢ的表達(dá)，減輕腎小管間質(zhì)纖維化而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

1，25-（OH）2-D3；ColⅢ；進(jìn)展性腎炎；腎小管間質(zhì)纖維化；大鼠

腎小管間質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積容易引起腎功能不全，常見(jiàn)于許多慢性腎臟疾病。間質(zhì)膠原，尤其是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，通常作為腎組織基底膜的“腳手架”而普遍存在于腎臟中[1-2]。膠原及其相關(guān)分子在腎小管間質(zhì)的積聚即可以定義為腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）。腎小管間質(zhì)纖維化的病變程度嚴(yán)重影響了腎功能的正常運(yùn)作。延緩或阻止腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，可以預(yù)防慢性腎臟病的發(fā)生[3]。1，25-（OH）2-D3除調(diào)節(jié)鈣磷代謝外，在調(diào)節(jié)各種生物過(guò)程（如免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和分化、抗纖維化、減少尿蛋白）中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4]。但是，1，25-（OH）2-D3對(duì)進(jìn)展性腎炎腎小管間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用尚不完全清楚。本研究旨在探討1，25-（OH）2-D3對(duì)進(jìn)展性腎炎大鼠模型中RIF膠原蛋白Ⅲ（ColⅢ）表達(dá)的影響，并觀(guān)察腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的改變，便于進(jìn)一步了解1，25-（OH）2-D3對(duì)進(jìn)展性腎炎大鼠RIF的可能作用途徑及影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1，25 -（OH）2-D3購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Neo Markers公司，大鼠ColⅢ免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于武漢BOSTER生物工程有限公司。

1.2 儀器

全自動(dòng)多功能生化分析儀（日本Hitachi公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 動(dòng)物模型制備及分組

雄性SD大鼠（重慶騰鑫生物技術(shù)公司提供，二級(jí)）21只，體重（131.2±10.0）g。將21只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（n=7）：假手術(shù)組（對(duì)照組，只做腎包膜剝離，不予腎臟切除）、進(jìn)展性腎炎組（模型組）、6 ng/（100 g·d）1，25-（OH）2-D3干預(yù)組 （治療組），選用進(jìn)展性腎炎模型參照參考文獻(xiàn)[4]，行右腎摘除術(shù)，分別于術(shù)后第1、2周予尾靜脈注射IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1單克隆抗體1.2 mg/（kg·d），共2次。1，25-（OH）2-D3干預(yù)組于術(shù)后予1，25-（OH）2-D36 ng/（100 g·d）入飲水中灌胃至8周。所有大鼠均于8周后處死，收集24 h尿液，取大鼠心臟血并制作腎組織標(biāo)本。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)與方法

1.4.1 24 h尿蛋白定量 處死大鼠前3 d，將大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液，每只收集3次，用雙縮脲法測(cè)定尿蛋白含量，求平均尿蛋白含量。

1.4.2 血生化檢測(cè) 取大鼠心臟血清，測(cè)定血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、鈣、磷等。

1.4.3 腎臟組織病理學(xué)檢查 腎組織以10%甲醛固定并編號(hào)，石蠟包被，2 μm厚連續(xù)切片，Masson染色，光鏡下觀(guān)察腎臟病理改變。細(xì)胞核染黑藍(lán)色，膠原纖維呈綠色，肌纖維、紅細(xì)胞呈紅色。

1.4.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) ColⅢ蛋白的表達(dá)：取2 μm厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)原性酶，熱修復(fù)抗原，抗原抗體反應(yīng)，DAB顯色、脫水、透明、封片、顯微鏡觀(guān)察。操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性產(chǎn)物呈深褐色，不加抗體為陰性對(duì)照。

1.4.5 免疫組織化學(xué)分析 采用顯微圖像分析系統(tǒng)（Olympus C3040-ADU）對(duì)各組染色結(jié)果進(jìn)行積分光密度值（integral optical density，IOD）測(cè)定，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野代表0.13 mm2的區(qū)域面積，計(jì)算其IOD值，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，再進(jìn)行兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)和組內(nèi)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 1，25-（OH）2-D3對(duì)進(jìn)展性腎炎大鼠24 h尿蛋白、腎功能的影響

術(shù)后8周，模型組24 h尿蛋白量、SCr和BUN均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。經(jīng)1，25-（OH）2-D3干預(yù)治療后，與模型組比較，24 h尿蛋白量、BUN均顯著降低（P<0.05），兩組間SCr差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療前后電解質(zhì)鈣、磷水平在治療組無(wú)明顯變化（P> 0.05）（表1）。

表1 3組大鼠各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的比較（±s）

表1 3組大鼠各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別 尿蛋白（m g / 2 4 h ）S C r （μ m o l / L ）B U N （m m o l / L）鈣磷（m m o l / L）（m m o l / L）對(duì)照組模型組治療組2 0 . 4 8 ± 5 . 6 8 2 8 5 . 7 3 ± 2 8 . 3 3*1 3 9 . 5 7 ± 1 7 . 4 9#4 5 . 9 2 ± 5 . 3 8 1 6 9 . 2 7 ± 1 5 . 5 8*1 3 3 . 4 1 ± 9 . 8 9 9 . 5 8 ± 3 . 7 2 1 6 . 9 2 ± 5 . 0 1*1 2 . 9 7 ± 4 . 2 8#1 . 8 7 ± 0 . 0 6 1 . 9 0 ± 0 . 0 4 1 . 8 8 ± 0 . 0 5 1 . 6 6 ± 0 . 0 7 1 . 6 8 ± 0 . 0 6 1 . 6 4 ± 0 . 0 8

2.2 1，25-（OH）2-D3對(duì)腎組織病理變化的影響

Masson染色（圖1）顯示，對(duì)照組腎小管間質(zhì)形態(tài)基本正常；模型組見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞萎縮、脫落，腎小管管腔擴(kuò)張、間質(zhì)膠原纖維增厚。與對(duì)照組比較，模型組間質(zhì)炎癥和纖維化進(jìn)行性加重。與模型組比較，治療組腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，間質(zhì)炎癥得到改善，膠原纖維積聚減少。

圖1 各組大鼠腎間質(zhì)的組織病理學(xué)改變（×200，Masson染色）

2.3 1，25-（OH）2-D3對(duì)進(jìn)展性腎炎大鼠腎間質(zhì)ColⅢ蛋白表達(dá)的影響

ColⅢ蛋白表達(dá)主要集中于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)，模型組腎間質(zhì)ColⅢ蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增多（P<0.01），應(yīng)用1，25-（OH）2-D3治療后，ColⅢ表達(dá)均較模型組明顯減少（P<0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠腎間質(zhì)ColⅢ蛋白的變化（×200，免疫組織化學(xué)）

3 討論

腎臟纖維化是一個(gè)常見(jiàn)的導(dǎo)致腎臟功能衰竭的終末事件。因此，了解腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程對(duì)腎臟疾病的早期干預(yù)治療有重大意義。近年來(lái)研究證實(shí)，一種活性維生素D3類(lèi)似物——帕立骨化三醇可以減緩單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠模型中間質(zhì)纖維化、抑制腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[5]、改善腎臟炎癥[6-7]，減少尿蛋白，抑制足細(xì)胞損傷[8]。因而，本研究觀(guān)察了進(jìn)展性腎炎1，25-（OH）2-D3通過(guò)抑制RIF ColⅢ的表達(dá)，發(fā)揮進(jìn)展性腎炎抗纖維化的保護(hù)作用。

本研究中，Masson染色結(jié)果顯示，模型組腎小管上皮細(xì)胞萎縮、脫落，腎小管管腔擴(kuò)張、間質(zhì)膠原纖維增厚，與對(duì)照組比較，模型組間質(zhì)炎癥和纖維化進(jìn)行性加重，證實(shí)系膜增生性腎炎模型大鼠是目前觀(guān)察進(jìn)展性腎炎比較理想的動(dòng)物模型[9-10]。生化指標(biāo)顯示，模型組24 h尿蛋白含量、SCr、BUN均較對(duì)照組明顯升高，表明進(jìn)展性腎炎的大鼠模型造模成功。在予以1，25-（OH）2-D3干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，24 h尿蛋白含量及BUN均降低，提示1，25-（OH）2-D3可以減少進(jìn)展性腎炎大鼠模型中的尿蛋白含量、抑制腎臟纖維化，提高腎臟功能。另外，本實(shí)驗(yàn)還監(jiān)測(cè)了血電解質(zhì)鈣、磷的變化，發(fā)現(xiàn)在給予1，25-（OH）2-D3治療前后，鈣、磷無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明該1，25-（OH）2-D3的實(shí)驗(yàn)濃度[11]不會(huì)引起鈣、磷代謝紊亂，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

ColⅢ是腎組織基底膜的重要組成成分，對(duì)維持基底膜的完整性發(fā)揮重要作用[12]。ColⅢ表達(dá)的過(guò)多或過(guò)少均提示腎組織基底膜的結(jié)構(gòu)及完整性發(fā)生了改變。在腎組織基底膜中，腎間質(zhì)基底膜占其總量的85%～90%[13]。本研究中亦發(fā)現(xiàn)進(jìn)展性腎炎大鼠模型腎間質(zhì)組織中ColⅢ表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，而應(yīng)用1，25-（OH）2-D3干預(yù)后，ColⅢ表達(dá)明顯下降，進(jìn)一步提示了1，25-（OH）2-D3可能通過(guò)ColⅢ表達(dá)減少，減輕RIF的發(fā)生、發(fā)展。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展性腎炎大鼠模型腎間質(zhì)組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達(dá)增加，該因子又是公認(rèn)的較強(qiáng)的促纖維化生長(zhǎng)因子[14]，可促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，如ColⅢ[15]、纖連蛋白和整合素α5顯著增加[16]，提示1，25-（OH）2-D3降低ColⅢ的表達(dá)可能通過(guò)抑制腎小管間質(zhì)組織中CTGF的表達(dá)發(fā)揮作用。

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The effects of 1,25-(OH)2-D3on the expression in tubulointerstitial of ColⅢin rat with progressive nephritis

LIN Jian-ming1★ZHOU Jie2★YANG Xia1DA Jing-jing1HE Ping-hong1YI Wei3ZHA Yan1▲
1.Department of Nephrology,Guizhou Provincial People′s Hospital,Guiyang 550002,China;2.People′s Hospital of Xingyi City in Guizhou Province,Xingyi 562400,China;3.Department of Pathology,Guizhou Provincial People′s Hospital,Guiyang 550002,China

ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-(OH)2-D3on the expression in tubulointerstitial of ColⅢin rat with progressive nephritis.MethodsExperimental rats were divided into three groups according to random number table method:sham operation group(control group),progressive nephritis group(model group),and progressive nephritis group treated with 6 ng/(100 g·d)1,25-(OH)2-D3(treatment group).In addition to the control group,the other progressive nephritis model was established by right nephrectomy and injection with IgG(OX-7)mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody twice.Progressive nephritis rats received 1,25-(OH)2-D3by intragastric administration for 8 weeks,the urine protein of 24 hours,serum creatinine(SCr),blood urea nitrogen(BUN）and the levels of calcium and phosphorus in rats of each group were measured.The renal morphologic changes were evaluated on Masson stained sections.The expression in tubulointerstitial of ColⅢ was detected by immunohistochemical.ResultsThe 24 hours urine protein and BUN in tubulointerstitial were lower in 1,25-(OH)2-D3treatment group than those in model group(P<0.05).In addition,the expressions of ColⅢmRNA in 1,25-(OH)2-D3treatment group were significantly lower than those in model group(P<0.05). The renal pathological damage was significantly reduce.Conclusion1,25-(OH)2-D3may protect kidney by decreasing the expression of tubulointerstitial fibrosis gene ColⅢin the progressive nephritis model rats,and reduce renal tubular interstitial fibrosis and renal protective effect into full play.

1,25-(OH)2-D3;ColⅢ;Progressive nephritis;Tubulointerstitial fibrosis;Rats

R692.3

A

1674-4721（2014）02（a）-0004-04

2013-11-01本文編輯：林利利）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81200539）；2012年貴州省省長(zhǎng)基金（黔省專(zhuān)合字（2012）128號(hào)）；2010年貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（黔省專(zhuān)合字（2010）89號(hào)）；貴州省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合外G字[2012]7045號(hào)）

林建明（1958-），男，副主任醫(yī)師，研究方向：腎小球和腎小管間質(zhì)疾??；周潔（1975-），男，主治醫(yī)師，研究方向：原發(fā)性腎小球疾病

▲通訊作者

★并列第一作者