常 城 胡曉嵐

（湖北理工學(xué)院附屬黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000）

苦參堿對(duì)HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及Bax和BcL-2蛋白表達(dá)的影響*

常 城 胡曉嵐△

（湖北理工學(xué)院附屬黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000）

目的研究苦參堿對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。方法取HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞體外培養(yǎng)，加苦參堿處理24～48 h。采用MTT法檢測細(xì)胞增殖，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，采用Western Blot法檢測 Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果在2～16 mg/mL苦參堿作用下，HT29細(xì)胞增殖被明顯抑制，且呈劑量和時(shí)間依賴性（P＜0.05或P＜0.01）；給予4、8和16 mg/mL苦參堿作用HT29細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為（14.84±2.35）％、（37.80±2.49）％和（54.10±1.60）％，均明顯高于對(duì)照組（4.36± 0.23）％（P＜0.05）；經(jīng)苦參堿作用24 h后，細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)增加，而BcL-2表達(dá)減少，呈劑量依賴性。結(jié)論苦參堿能抑制HT29細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制BcL-2和促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

HT29細(xì)胞 凋亡 苦參堿 Bax Bcl-2

苦參堿（matrine）系豆科槐屬植物苦參的主要有效成分之一，其分子式為C15H24N2O。有實(shí)驗(yàn)研究表明，苦參堿對(duì)肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌和白血病等多種腫瘤細(xì)胞的生長具有抑制作用［1-5］，但其能否抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察苦參堿對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞由武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)中心提供?？鄥A購自Sigma公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和碘化丙錠（PI）為上海華臣生物試劑有限公司產(chǎn)品；胎牛血清購自杭州四季青公司；RPM1640培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑公司；蛋白酶K（Proteinase K）、抗Bcl-2和抗Bax鼠抗人單克隆抗體購自武漢博士德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)：取人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，復(fù)蘇后加10％滅活胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃的5％CO2加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)［6］。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，在0.25％胰酶消化后，用培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/mL。以每孔200 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入不同質(zhì)量濃度的苦參堿，終質(zhì)量濃度分別為2、4、8、16和32 mg/mL，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5％CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、36和48 h，棄去培養(yǎng)液，代之以無血清RPMI 1640培養(yǎng)液0.2 mL/孔，加入MTT 20 μL/孔（終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL），置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清，加入DMSO 150 μL/孔，在酶標(biāo)儀570 nm波長處讀取OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次［7-8］。細(xì)胞形態(tài)超微觀察：取對(duì)數(shù)生長期HT29細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次。加0.25％胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，將細(xì)胞按1×106個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板。加入終質(zhì)量濃度為8 mg/mL的苦參堿，培養(yǎng)24 h。將胰酶消化收集的細(xì)胞置于瓊脂離心管中，以1 mL 2.5％戊二醛和1％鋨酸固定，純環(huán)氧樹脂包埋，按常規(guī)電鏡樣本制作程序處理，鉛-鈾雙染色，在透射電鏡（JEM-2010HR型，日本電子株式會(huì)社）下觀察。細(xì)胞凋亡檢測：應(yīng)用不同質(zhì)量濃度的苦參堿處理HT29細(xì)胞24 h，用冷PBS緩沖液沖洗2次，重懸于Binding Buffer中。調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，取100 μL重懸后的細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI。隨即上流式細(xì)胞儀（FACScan，美國BD公司）檢測，分析細(xì)胞凋亡的百分比。凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)的檢測：用Western Blot法，取 HT29細(xì)胞，經(jīng) MA（4 mg/mL、8 mg/mL和16 mg/mL）處理24 h，消化收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液（20mmoL/mLTris-HCl，pH7.4；150mmoL/mL NaCl，0.5％NP-40，1 mmoL/mL EDTA，50 μg/mL亮肽素，1 mmoL/mL PMSF）100 μL，于4℃12000 r/min離心10 min。等量樣品（30 μg/mL）經(jīng)12.5％SDS–PAGE膠分離蛋白質(zhì)，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。加入一抗過夜，再加入二抗。洗膜后，加入ECL化學(xué)顯影劑，X光片曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)HT29細(xì)胞生長的抑制作用 見表1。不同質(zhì)量濃度的苦參堿在24、36、48 h時(shí)對(duì)HT29細(xì)胞都有抑制作用。

2.2 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 見圖1。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)豐富，可見多個(gè)核仁；MA處理組細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、凝固，染色質(zhì)邊集，核固縮。

2.3 細(xì)胞凋亡率的變化 經(jīng)MA作用24 h后，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（4.36±0.23）％，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組（4 mg/mL、8 mg/mL和16 mg/mL）細(xì)胞凋亡率分別為（14.84± 2.35）％、（37.80±2.49）％和（54.10±1.60）％，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同質(zhì)量濃度苦參堿對(duì)HT29細(xì)胞的生長抑制作用（±s）

表1 不同質(zhì)量濃度苦參堿對(duì)HT29細(xì)胞的生長抑制作用（±s）

與對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 24 h 36 h 48 h對(duì)照組 0.0±0.1 0.0±0.1 0.0±0.1苦參堿2 mg/mL組 9.2±0.7△ 22.1±0.2△ 29.7±1.3△苦參堿4 mg/mL組 17.9±3.5△ 42.5±2.8△ 54.2±1.9△苦參堿8 mg/mL組 45.9±3.9△△ 58.2±4.3△△ 68.3±4.8△△苦參堿16mg/mL組 59.4±3.4△△ 68.3±4.8△△ 75.8±0.9△△苦參堿32 mg/mL組 71.6±0.8△△ 77.1±2.3△△ 84.2±1.5△△

圖1 8 mg/mL苦參堿作用細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài)變化（5000倍）

2.4 苦參堿對(duì)Bax和Bcl-2表達(dá)的影響 見圖2?？鄥A能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)，并增加細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)，呈劑量依賴性。

圖2 苦參堿作用HT29細(xì)胞24 h后Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的變化

3 討論

苦參堿具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長［9-12］。本研究觀察到隨著藥物質(zhì)量濃度的增高和作用時(shí)間的延長，腫瘤細(xì)胞增殖受到明顯抑制。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)苦參堿能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加，呈劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)以8 mg/mL苦參堿作用HT29細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核體積縮小，染色質(zhì)濃縮凝固，染色質(zhì)邊聚、核固縮、核碎裂及凋亡小體出現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)了苦參堿誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡的作用。筆者還觀察到苦參堿對(duì)凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)有影響，苦參堿能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)，呈劑量依賴性。由此筆者推測苦參堿通過增加促凋亡蛋白 Bax的表達(dá)和減少抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用。

苦參堿在體外可直接抑制或殺傷人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，具有較強(qiáng)的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡能力，是一種有應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。

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Effect of Matrine on Apoptosis of HT29 Cells and Inhibition of Bcl-2/Bax Expression in Vitro

CHANG Cheng，HU Xiaolan. Huangshi Central Hospital of Hubei Polytechnic University，Hubei，Huangshi 435000，China

Objective：To study the effect of matrine（MA）on apoptosis and Bcl-2/Bax expression in HT29 cells（human colon cancer cells）.Methods：HT29 cells cultured in vitro were subjected to MA at concentration of 2～32 mg/mL for 24 h or 48 h.Cell proliferation and apoptosis were determined by MTT assay and flow cytometry，respectively，and the expression of Bcl-2 and Bax was detected by Western blot.Results：MA（2～16 mg/mL）significantly inhibited the proliferation of HT29 cells in a dose-and time-dependent manner（P＜0.05）.After intervention of MA at 4，8 or 16 mg/mL for 24h，the percentage of apoptotic cells was increased to （14.84±2.35）％，（37.80±2.49）％and （54.10±1.60）％，respectively，all of which were significantly higher than （4.36±0.23）％in the control group（P＜0.05）.MA（at 4～16 mg/mL）significantly increased the expression of Bax and decreased the expression of Bcl-2 in a dose-depended manner.Conclusion：MA inhibits proliferation and induces apoptosis of HT29 cells in vitro，probably through down-regulation of Bcl-2 and up-regulation of Bax.

HT29 cell lines；Apoptosis；Matrine；Bax；Bcl-2

R730.59

A

1004-745X（2014）08-1463-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.026

2014-04-03）

湖北省自然科學(xué)基金資助（2013CFC061）

△通信作者