穆桂萍 曾瑤池 陳鵬典 羅文舒馬曉明 熊益群 劉心亮 劉文赫

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033）

電針任督脈對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響*

穆桂萍 曾瑤池 陳鵬典 羅文舒△馬曉明 熊益群 劉心亮 劉文赫

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033）

目的探究電針任督脈對局灶性腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法采用線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞模型，利用改良的神經(jīng)功能缺損評分表（mNSS）觀察治療后大鼠神經(jīng)行為學(xué)變化情況，并采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測其大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，以及電針任督脈對其的影響。結(jié)果大鼠造模后mNSS顯著升高，且大腦皮層TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多；與同時期模型組比較，電針任督脈組腦缺血再灌注7 d、14 d和28 d其mNSS和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低。結(jié)論電針任督脈可能通過抑制腦缺血再灌注后皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡和改善神經(jīng)功能缺損來改善腦缺血損傷。

電針任脈督脈缺血性中風(fēng)細(xì)胞凋亡神經(jīng)功能缺損

腦缺血再灌注損傷可造成神經(jīng)元壞死，又可誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生凋亡。因此，采取相應(yīng)措施抑制神經(jīng)元凋亡，可阻止腦缺血瀑布損傷的擴展，有利于患者神經(jīng)功能的恢復(fù)。前期研究表明，電針任督脈經(jīng)穴可持續(xù)促進腦缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化，對腦缺血后神經(jīng)再生具有顯著的積極效應(yīng)［1-2］?；诖?，本研究擬從腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)功能缺損方面入手，進一步探討電針任督脈對腦缺血再灌注損傷的可能保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物和分組成年健康雄性清潔級SD大鼠54只，體質(zhì)量（220±20）g，購于廣東省實驗動物中心。隨機分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組動物又隨機分為大腦中動脈栓塞7 d、14 d和28 d 3個亞組，每個亞組6只。

1.2 模型制備實驗動物以300mg/kg水合氯醛腹腔麻醉，仰臥位固定，參考Kuge造模法［3］，分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），離斷ECA的分支，在游離出的ECA剪一小口，將制備好的尼龍線插入ECA內(nèi)，通過CCA分叉處經(jīng)ICA插至大腦前動脈，有阻力感時停止進線，一般插入深度平均為

（18.5±0.5）mm。缺血2 h時輕輕向外抽出尼龍線使其球端回至ECA內(nèi)，實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組僅分離右側(cè)CCA并離斷右ECA，不予栓塞。

1.3 電針治療術(shù)后24 h電針組予電針治療，穴位參照大鼠的常用任督脈穴位大椎、百會、水溝、氣海、關(guān)元和承漿6穴的標(biāo)記方法［4］，針刺后加電，采用華佗牌電針儀（SDZ-Ⅱ型），疏密波刺激（疏波30 Hz，密波100Hz），以身體相應(yīng)部位出現(xiàn)輕微顫動為準(zhǔn)。持續(xù)時間為20min，每日1次至動物處死。假手術(shù)組和模型組于手術(shù)24 h后將其同電針組大鼠固定于針刺操作臺上20min，不作任何治療。分別在電針7、14、28 d后處死大鼠。

1.4 觀察內(nèi)容及療效評價

1.4.1 神經(jīng)功能缺損程度評分于術(shù)后7、14、28 d采用雙盲法依據(jù)神經(jīng)功能缺損程度評分表mNSS評分表［5］從肌力、肌張力、意識、共濟運動、反射等方面綜合評價大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能。mNSS總分為18分，評分越高表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.4.2 TUNEL細(xì)胞凋亡各組實驗時間點將動物麻醉，經(jīng)左心室插管快速灌注生理鹽水進行心臟灌洗，用4％多聚甲醛灌洗固定，迅速斷頭取腦，4％多聚甲醛后固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。切片常規(guī)脫蠟入水，按照試劑盒說明書操作，DAB顯色10min，水洗，甲基綠復(fù)染，水洗，脫水，透明，封片。光鏡下觀察凋亡細(xì)胞核被染成棕黃色。凋亡細(xì)胞計數(shù)方法：選取腦皮層部位，200倍光鏡下計數(shù)5個視野陽性細(xì)胞數(shù)目，求其陽性區(qū)百分比平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損程度評分結(jié)果見表1。假手術(shù)組大鼠沒有神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，評分均為0分。模型組和電針組均出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，且其神經(jīng)功能缺損程度評分隨時間推移而逐漸降低。在缺血再灌注后7 d、14 d和28 d，電針組神經(jīng)功能缺損程度評分均小于模型組（P＜0.01）。

表1 各組大鼠再灌注時間點神經(jīng)缺損程度評分比較（±s）

表1 各組大鼠再灌注時間點神經(jīng)缺損程度評分比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.01。

組別n 7 d 14 d 28 d假手術(shù)組6模型組6 0 0 0 10.00±0.63 8.17±0.75 6.17±0.75電針組6 7.67±0.52*5.33±0.52*4.83±0.41*

2.2 各組大鼠大腦皮層神經(jīng)元凋亡TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較見表2。假手術(shù)組各個時間點偶見有凋亡神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠7 d、14 d和 28 d 3個時間點神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠7 d、14 d和28 d 3個時間點神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少（P＜0.01）。

表2 各組大鼠再灌注時間點大腦皮層神經(jīng)元凋亡陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠再灌注時間點大腦皮層神經(jīng)元凋亡陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別n 7 d 14 d 28 d假手術(shù)組6模型組6 1.14±0.20 1.12±0.19 1.11±0.22 7.34±0.22*6.25±0.14*2.76±0.22*電針組6 5.24±0.15△4.14±0.13△2.04±0.13△

3 討論

有研究表明，腦組織缺血早期缺血區(qū)以神經(jīng)元壞死為主，而后期缺血半暗帶發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡則以細(xì)胞凋亡為主，故有效抑制缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血治療的關(guān)鍵［6］。細(xì)胞凋亡是有核細(xì)胞在一定條件下啟動其自身內(nèi)部機制，通過內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞死亡過程，主要以細(xì)胞皺縮、胞核凝聚以及DNA鏈在核小體間被活化的核酸內(nèi)切酶切斷、形成180～200 bp等倍體的DNA片段，具有主動性、選擇性、可逆性的特點［7］。本研究結(jié)果表明，大鼠腦缺血再灌注損傷后，在缺血側(cè)腦組織可檢測到較多的凋亡陽性細(xì)胞，這進一步證明細(xì)胞凋亡乃腦缺血再灌注損傷中細(xì)胞死亡的途徑之一。

從中醫(yī)學(xué)角度上看，腦缺血針灸治療中，重視督脈和任脈的應(yīng)用，在患者神經(jīng)功能損傷的改善方面具有重要意義［8］。任督二脈均起自胞中。任脈行于身前，為諸陰經(jīng)之海，精血津液皆灌注于內(nèi)，而上通于腦。督脈行身后，循脊入腦，為陽脈之海，主周身之陽氣，與任脈共同協(xié)調(diào)人體陰陽功能。因此歷代醫(yī)家常應(yīng)用督脈和任脈經(jīng)穴治療中風(fēng)因腦脈閉阻、陰陽氣血失調(diào)所表現(xiàn)出的神志異常、言語肢體功能障礙等。本實驗結(jié)果表明，電針任督脈經(jīng)穴在腦梗死7 d、14 d和28 d時間點可不同程度地改善其神經(jīng)功能缺損并抑制缺血側(cè)皮層神經(jīng)細(xì)胞的過度凋亡。筆者推測，這是否可能與任脈通過主“妊養(yǎng)”上調(diào)一系列神經(jīng)生長因子來保護神經(jīng)元，以及督脈鼓舞推動陽氣來抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)［9］。進一步機制需要在以后的研究工作中闡明。

［1］Luo WS，Yu HB，Yang ZX，et al.Influence of Ren and Du meridian electro-acupuncture on neuralstem cellproliferation and extracellular signal-regulated kinase pathway in a rat modelof focalcerebral ischemia injury［J］.NeuralRegen Res，2010，5（6）：433-438.

［2］楊卓欣，陳鵬典，于海波，等.針刺任督脈穴位促進腦缺血后神經(jīng)再生的研究近況［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2012，10（1）：19-24.

［3］Kuge Y，Minematsu K，Yamagachi T，et al.Nylon monofila-ment for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Stroke，1995，26（9）：1655-1657.

［4］李忠仁.實驗針灸學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：327-329.

［5］Schallert T，Kozlowski DA，Humm JL，et al.Use-dependent structural events in recovery of function［J］.Adv Neurol，1997，73（2）：229-238.

［6］Siesj BK.Pathophysiology and treatment of focal cerebral ischemia.Part I：Pathophysiology（1992）［J］.JNeurosurg，2008，108（3）：616-631.

［7］Canese R，F(xiàn)ortuna S，LorenziniP，etal.Transientglobalbrain ischemia in young and aged rats：differences in severity and progression，butnot localisation，of lesionsevaluated bymagnetic resonance imaging［J］.MAGMA，1998，7（1）：28-34.

［8］楊福霞，楊卓欣，于海波，等.調(diào)任通督針法治療腦梗塞恢復(fù)期患者的臨床觀察［J］.針灸臨床雜志，2011，27（4）：48-50.

［9］楊卓欣，陳鵬典，于海波，等.針刺任督脈對腦缺血MSCs移植后促轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元作用機制的研究思路［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2012，39（9）：1663-1666.

E ffects of Conception and Governor Vessel Electro-acupuncture on Neurological Function and Cellular Apoptosis in Cerebral Ischem ia Rats

MU Gui-ping，ZENG Yao-chi，CHEN Peng-dian，et al.Affiliated

Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong，Shenhen 518033，China

Objective：To investigate the effects of conception and governor vessel electro-acupuncture on the neurological function and cellular apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion rats.Methods：The MCAO ratswere prepared with thread embolism method.Following electro-acupuncture intervention，the neurological behavior changeswere observed withmodified neurological severe scores（mNSS），and the cellular apoptosiswas detected with terminal deoxynucleotidyl transferasemediated nick end labeling（TUNEL）method.Results：Aftermodeling establishment，the mNSS and the number of TUNEL-positive cells were apparently increased.Compared with hose in the MCAO group at the same time-points，the mNSS and the number of TUNEL-positive cells in the electro-acupuncture group were apparently decreased.Conclusion：Electro-acupuncture at conception and governor vesselsmay protect the cerebral ischemia-reperfusion injuries via inhibiting cellular apoptosis at the cerebral cortex and improving the neurological functions.

Electro-acupuncture；Conception and governor vessels；Ischemic cerebrovascular disease；Cellular apoptosis；Neurologic impairment

R245.9+7

A

1004-745X（2014）01-0048-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.022

廣東省深圳市科技計劃項目（201203149）

△通信作者

2013-09-01）

·臨床觀察·