李天一 汪麗佩△吳國琳

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310013）

·研究報告·

黃芪多糖對免疫性肝損傷小鼠免疫調節(jié)的影響*

李天一1汪麗佩1△吳國琳2

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310013）

目的觀察不同劑量的黃芪多糖對免疫性肝損傷小鼠的肝功能、骨橋蛋白（OPN）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的影響，初步探討黃芪多糖治療病毒性肝炎的作用機制，為其在臨床上的應用提供理論依據。方法各組小鼠給予不同因素干預，造模結束后各組小鼠摘眼球采血，脫椎處死取肝臟。檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST），ELISA檢測OPN、TNF-α，免疫組織化學法檢測肝臟中OPN、TNF-α蛋白的表達。結果黃芪多糖可降低血清中的ALT、AST（P＜0.05或0.01），高劑量黃芪多糖使OPN、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05），OPN與TNF-α呈正相關。結論黃芪多糖對免疫性肝損傷模型具有一定的保護肝臟和免疫調節(jié)作用，可減輕炎癥和肝細胞損傷、改善肝功能。

黃芪多糖免疫性肝損傷免疫調節(jié)骨橋蛋白腫瘤壞死因子-α

黃芪生用益衛(wèi)固表、利水消腫、托毒生肌，炙用補中益氣?，F代醫(yī)學研究表明，黃芪具有清除機體自由基、抗氧化、排毒、抗病毒，雙向調節(jié)免疫的功能。黃芪多糖是黃芪中最重要的有效成分，是黃芪藥理作用中起決定性因素的一類大分子化合物。為明確黃芪多糖治療慢性乙型肝炎的的免疫作用機制，本研究采用整體動物實驗觀察黃芪多糖對免疫性肝損傷小鼠的肝功能、骨橋蛋白（OPN）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組健康雄性昆明種小鼠，體質量18～22g，浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。40只小鼠隨機分為5組（正常組對照組、模型對照組、胸腺肽組、黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組），每組8只。

1.2 試藥與儀器注射用黃芪多糖（伯恩，天津賽諾制藥有限公司），胸腺肽-α1（邁普新，成都地奧九泓制藥廠），卡介苗（BCG）凍干粉（北京生物制品研究所），OPN、TNF-α的ELISA檢測試劑盒（上海西唐生物有限公司），OPN、TNF-α的單克隆抗體和免疫組織化學試劑盒（北京中山生物技術有限公司），全自動生化儀（日本日立7020型），病理組織切片機（德國萊卡RM2015），酶標儀（Thermo公司，型號DENLEY DRAGONWellscan MK 3）。

1.3 模型制備應用BCG聯合脂多糖（LPS）誘導小鼠免疫性肝損傷。根據文獻和預實驗結果，小鼠實驗第1日尾靜脈注射BCG 200mg/kg，致敏后第11日尾靜脈注射LPS 0.4mg/kg以誘導肝損傷；正常組小鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.4 給藥方法黃芪多糖低劑量組每日腹腔注射黃芪多糖粉針劑生理鹽水溶液0.5mL，藥量為0.1 g/kg。黃芪多糖高劑量組每日腹腔注射黃芪多糖粉針劑生理鹽水溶液0.5mL，藥量為0.2 g/kg。胸腺肽組實驗第3、5、7、9、11日每只小鼠腹腔注射胸腺肽-α110μg，其他實驗時間每日腹腔注射生理鹽水0.5mL。正常對照組與模型對照組每日腹腔注射生理鹽水0.5mL。各組小鼠造模同時開始腹腔注射直到處死前1 d。

1.5 標本采集與檢測造模結束后小鼠禁食12 h，稱體質量后摘眼球采血，脫椎處死取肝臟。血液離心，取血清放入-20℃冰箱凍存以備檢測ALT、AST、OPN、TNF-α。肝左葉標本10％多聚甲醛固定以備病理切片，光學顯微鏡觀察和免疫組化法檢測OPN、TNF-α。

1.5.1 血清學檢查ALT、AST用全自動生化儀常規(guī)操作檢測。嚴格按試劑盒說明采用酶聯接免疫吸附試驗（ELISA）（雙抗體夾心ABC法）檢測OPN、TNF-α。

1.5.2 病理學檢查肝左葉標本10％多聚甲醛進行固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理變化，將其病理損傷程度分級：“-”為未見明顯病理改變；“+”為部分肝組織腫脹伴有散在的點狀壞死，匯管區(qū)有少許炎性細胞浸潤；“++”為肝細胞腫脹有點狀壞死及小灶性壞死，可見散在的肉芽腫形成，匯管區(qū)有大量炎性細胞浸潤；“+++”為肝細胞腫脹，有大片狀壞死，有肉芽腫形成，匯管區(qū)及周圍有大量炎性細胞浸潤。

1.5.3 免疫組化法檢查嚴格按SP免疫組化試劑盒說明書操作，用美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus多功能真彩色細胞圖像分析系統(tǒng)分析，綜合計量判定標準采用免疫組化評分（IHS）：用陽性細胞百分數評分與相應染色強度評分乘積表示。IHS最高為12分，最低為0分。

1.6 統(tǒng)計學處理應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。方差齊性時采用LSD方法進行組間多重比較；方差不齊時，采用DunnettT3方法進行組間多重比較。等級資料采用χ2檢驗。相關性用一元線性相關與回歸進行檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃芪多糖對免疫性肝損傷小鼠血清轉氨酶的影響見表1。模型對照組血清ALT、AST較正常對照組顯著升高（P＜0.01），表明BCG+LPS干預后對小鼠肝細胞造成了嚴重的損傷，說明動物模型建立成功。與模型對照組相比，胸腺肽組、黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；黃芪多糖低、高劑量組與胸腺肽組之間，黃芪多糖低劑量組與黃芪多糖高劑量組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠血清AST、ALT，血清及肝組織OPN、TNF-α比較（±s）

表1 各組小鼠血清AST、ALT，血清及肝組織OPN、TNF-α比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

TNF-α（IHS分值）正常對照組8 32.13±11.98 118.38±37.99 18.26±5.85 99.44±34.01 3.50±1.41 2.37±1.06模型對照組8 417.63±174.17*729.13±267.45*65.44±15.84*309.79±77.03*6.00±2.07*5.50±2.51*胸腺肽組8 111.75±30.67△△222.25±65.88△△39.78±6.29△184.74±44.35△3.75±1.28△△3.00±1.51△△黃芪多糖低劑量組8 125.25±31.81△△196.75±88.43△△46.03±15.92 197.63±21.98△4.75±1.04 3.25±1.49△黃芪多糖高劑量組8 106.75±29.12△△203.50±96.10△△41.74±11.91△194.53±34.90△4.50±0.93△3.75±1.67△組別n ALT（U/L）AST（U/L）血清肝組織OPN（ng/mL）TNF-α（pg/mL）OPN（IHS分值）

2.2 黃芪多糖對免疫性肝損傷小鼠血清OPN、TNF-α的影響見表1。與正常對照組相比較，模型對照組小鼠血清OPN、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型對照組相比較，胸腺肽組和黃芪多糖高劑量組血清OPN、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）；黃芪多糖低劑量組TNF-α水平顯著降低（P＜0.05），但OPN水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。黃芪多糖各劑量組與胸腺肽組相比較，黃芪多糖低劑量組和黃芪多糖高劑量組相比差異不明顯（P＞0.05）。與正常對照組相比較，模型對照組免疫性肝損傷小鼠肝臟組織中OPN和TNF-α含量明顯增多（P＜0.01）。與模型對照組相比較，胸腺肽組、黃芪多糖高劑量組OPN和TNF-α含量顯著減少（P＜0.05或0.01）。黃芪多糖低劑量組TNF-α含量明顯降低（P＜0.05），但OPN未明顯降低（P＞0.05）。黃芪多糖各劑量組與胸腺肽組相近（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠血清、肝組織中OPN水平與TNF-α的相關性檢驗經檢驗，血清及肝組織OPN與TNF-α呈正相關，相關系數R分別為0.653、0.555，回歸方程經顯著性檢驗差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.4 黃芪多糖對免疫性肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響（1）肉眼觀察：模型組肝臟腫大，顏色變暗，表面有大小不等的壞死斑。胸腺肽組、黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組肝臟變化較模型對照組輕。正常組肝臟未見異常。（2）HE光鏡觀察：正常對照組小鼠肝臟未見明顯病理改變；模型對照組和各治療組均出現不同程度的病理損傷，肝細胞索排列紊亂，肝細胞腫脹、脂肪變或氣球樣變，胞漿疏松，伴有散在的點狀壞死或灶性壞死，肝血竇受壓變窄或不明顯，竇內皮細胞腫脹，匯管區(qū)有中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，中央靜脈擴張瘀血。

3 討論

近幾年來國內外較多采用BCG與LPS聯合誘導小鼠產生免疫性肝損傷的方法：BCG首先激活致敏T淋巴細胞，尤其是致敏肝內枯否細胞和巨噬細胞，并大量聚集于肝臟；再注射LPS后進一步激活致敏的巨噬細胞，促使其釋放大量細胞因子，如NO、自由基、TNF、白細胞介素、白三烯等造成肝細胞損害。該免疫性肝損傷的方法產生的病理改變、血清轉氨酶與肝細胞損傷機制與肝炎相類似，此小鼠模型可在實驗室用于研究肝炎的發(fā)病，是目前研究藥物治療肝炎較為理想的動物模型之一［1］。

OPN在局部炎癥中是免疫細胞募集及啟動Th1細胞免疫的關鍵細胞因子［2］，具有促炎和抗炎雙重作用。OPN是肝臟炎癥程度的一個重要標志［3-8］。以往實驗結果［9］也顯示，無論是HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者，還是HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者性患者，血清OPN水平均高于健康人，以HBeAg陽性組水平最高。

本實驗結果顯示，低、高劑量的黃芪多糖治療免疫性肝損傷小鼠后，其肝細胞腫脹、壞死以及匯管區(qū)和周圍大量炎性細胞浸潤現象顯著減輕，血清ALT、AST顯著降低，對肝細胞具有保護作用；也可降低血清和肝組織中OPN、TNF-α含量。OPN與TNF-α、ALT、AST呈正相關。黃芪多糖低、高劑量組在實驗劑量范圍內對于降低血清和肝組織中OPN、TNF-α含量無明顯差異。本研究認為，黃芪多糖抗免疫性肝損傷的機制可能與其保肝降酶作用及其抑制TNF-α、OPN的產生等有關，對臨床治療急慢性肝病提供理論依據。

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［9］李天一，方芳.慢性乙型肝炎患者血清骨橋蛋白水平與肝功能的相關性［J］.國際流行病學傳染病學雜志，2009，36（1）：14-16.

Study on Osteopontin of Astragalus Polysaccharides on Mice with Immunological Liver Injury

LITianyi1，WANG Li-pei1，WU Guo-lin2.1 Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China；2 The First Affiliated Hospital ofMedical School of Zhejiang University，Zhejiang，Hangzhou 310003，China

Objective：To observe the effect of astragalus polysaccharides（APS）on liver function，osteopontin（OPN），tumor necrosis factor-α（TNF-α）ofmice with immunological liver injury in order to explore the therapeutic mechanism of APS in treating hepatitis and offer experimental evidence to its clinical application.Methods：40 rats were divided random ly into 5 groups.Aftermodeling and weighing blood were colleced by excising the eyeballs，liver，spleen and thymuswere taken to calculate organs index.The serum was separated to determine alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），OPN and TNF-α.The specimens of left lobe of liver in 10％formaldehyde was used tomake pathological slice for observing liver pathology.These indicatorswere determined by immunohisto-chemistry method including expression of OPN and TNF-αprotein.Results：APS decreased the ALT，AST in serum（P＜0.05 or 0.01）.High dosage of APS reduced the levels of OPN and TNF-α significantly（P＜0.05）.OPN and TNF-αwere positively correlated.Conclusion：APS has the certain protection and immunoregulative effect on immunological liver injury，reducing liver inflammation and liver cell injury.It can improve liver function of experimental immunological liver injury inmice.

Astragalus polysaccharides；Immunological liver injury；Immunoregulation；Osteopontin；Tumor necrosis factor-α

R285.5

A

1004-745X（2014）01-0025-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.012

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2008CA028）；浙江省教育廳科技計劃項目（Y201121154）

△通信作者

2013-08-19）

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