鄭 璐，柏中中，許婷婷，何冰芳

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211800;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南京 210046)

D-乳酸是一種重要的手性中間體，已被用于多種手性物質(zhì)的合成。近年來(lái)高光學(xué)純度的D-乳酸因?yàn)槠湓诤铣赡蜔嵝愿?、機(jī)械強(qiáng)度更好的聚乳酸材料方面的實(shí)際應(yīng)用極大地帶動(dòng)了D-乳酸的生產(chǎn)研究［1］。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸，不僅可以解決傳統(tǒng)化學(xué)合成法成本高、分離困難等問題，還可以擺脫對(duì)石化資源的依賴，減少環(huán)境污染［2］。菊糖芽胞乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)是典型的同型發(fā)酵D-乳酸的優(yōu)勢(shì)菌株，適合大規(guī)模生產(chǎn)高純度的D-乳酸。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)該菌株的菌種改良做了大量研究，取得了一定可喜的成效，但這些研究主要通過(guò)誘變篩選結(jié)合發(fā)酵工藝的優(yōu)化來(lái)獲得高產(chǎn)突變株，存在易退化和生產(chǎn)強(qiáng)度低等缺陷［3－4］。因此，這就需要對(duì)該菌株在分子水平上進(jìn)行解析，進(jìn)而通過(guò)基因工程改造使之更適合于工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK，EC 2.7.1.11)是糖酵解途徑中的限速變構(gòu)調(diào)控酶，以ATP作為磷酸基供體催化6-磷酸果糖(F-6-P)的磷酸化［5］。筆者所在課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，S.inulinus糖酵解代謝流和D-乳酸產(chǎn)量提高的同時(shí)，PFK酶活也顯著提高［3，6］。Andersen 等［7］發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)PFK酶活的降低將直接導(dǎo)致生長(zhǎng)速率和糖酵解代謝流的強(qiáng)烈抑制。但是，關(guān)于S.inulinus PFK是如何調(diào)控糖酵解和D-乳酸生產(chǎn)還未見報(bào)道。PFK對(duì)糖酵解代謝流有重要調(diào)控作用，通常不同生物來(lái)源的PFK有不同的變構(gòu)調(diào)控性質(zhì)［5］。一般細(xì)菌來(lái)源的PFK是相對(duì)分子質(zhì)量為3.5×104左右的同源四聚體，ADP或GDP通過(guò)提高酶對(duì)底物F-6-P的親和力激活該酶，同時(shí)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)對(duì)該酶具有顯著的抑制作用［8］。

本研究中筆者克隆S.inulinus Y2-8的pfk基因，并在大腸桿菌進(jìn)行異源表達(dá)，考察重組菌的PFK比酶活變化，以期為后續(xù)對(duì)該酶進(jìn)行純化和變構(gòu)調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

質(zhì)粒pSE380和大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;Sporolactobacillus inulinus Y2-8 CCTCC 208052為筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究人員自行篩選獲得的D-乳酸高產(chǎn)菌。

1.1.2 主要試劑

pfu酶購(gòu)自Fermentas公司，限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司，小量膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司，PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，ATP、ADP、F-6-P、NADH、醛縮酶(aldolase)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase)、α-甘油磷酸脫氫酶(αglycerophosphate dehydrogenase)均購(gòu)自Sigma公司，其余常規(guī)試劑采用進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10、酵母膏 5、NaCl 10。重組大腸桿菌添加氨芐青霉素至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

平板培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、酵母膏2、蛋白胨 2、KH2PO41、Na2Ac 2、MgSO40.2、瓊脂粉 20;玉米漿 2 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取和pfk基因的克隆

將S.inulinus Y2-8接種于37℃厭氧培養(yǎng)48 h，收集菌體，基因組 DNA的提取采用酚-氯仿抽提法［9］。

以S.inulinus Y2-8基因組DNA為模板，依據(jù)本課題組前期克隆獲得的Sporolactobacillus sp.DX12的PFK基因(pfk)序列(NCBI登錄號(hào)EU878300)設(shè)計(jì)引物如下(下劃線代表酶切位點(diǎn)):正向5'-GCGCCATGGGCAAAAAAATTGGAGTTCTG-3'(包含NcoⅠ位點(diǎn))，反向5'-GCCCTCGAGTTATATGGATAATACTT-3'(包含XhoⅠ位點(diǎn))，利用PCR擴(kuò)增pfk基因。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60 ℃退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min 20 s，30個(gè)循環(huán);72℃ 延伸5 min，冷卻至4℃。

1.2.2 pfk基因的生物信息學(xué)分析

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇9種不同來(lái)源的典型乳酸菌的PFK序列，采用 Clustal X(version 1.8)，將 S.inulinus Y2-8的PFK序列與其他9種來(lái)源的PFK序列進(jìn)行比對(duì)，考察其底物結(jié)合位點(diǎn)和變構(gòu)調(diào)控位點(diǎn)。序列相似性比較采用 NCBI的 BLAST軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后與進(jìn)行相同酶切的質(zhì)粒 pSE380相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSE-pfk。通過(guò) CaCl2法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入 E.coli BL21中［9］。陽(yáng)性重組子采用菌落PCR和提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，并進(jìn)行測(cè)序(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)。

1.2.4 PFK在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組菌接種到LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種至新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600到0.6～0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)在不同溫度下誘導(dǎo)不同的時(shí)間。菌液離心(4℃、12 000 g、10 min)，菌泥用緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2，pH 7.5)洗滌2遍后重懸，在冰浴中超聲破碎(300 W、超聲3 s、間歇 5 s，總共5 min)，4 ℃、12 000 g 離心15 min去除細(xì)胞碎片，得到粗酶液。

1.2.5 SDS-PAGE電泳和蛋白含量分析

取粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析，并以未誘導(dǎo)的E-pSE-pfk及E.coli-pSE作為對(duì)照。蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法［10］，以牛血清白BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定利用Bradford蛋白定量試劑盒(TIANGEN公司)。

1.2.6 PFK酶活性測(cè)定

PFK酶活采用酶耦聯(lián)法測(cè)定［8］。粗酶液(5 μL)加入250 μL 反應(yīng)體系(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液、pH 8.5，5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L NADH，1 mmol/L ATP、5 mmol/L F-6-P、4 U/mL 醛縮酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶和α-甘油磷酸脫氫酶)中啟動(dòng)反應(yīng)。30℃平衡3 min后，測(cè)定340 nm處NADH吸光值的變化。PFK酶活定義為在30℃下每分鐘生成1.0 μmol 1，6-二磷酸果糖所需要的酶量。PFK比酶活為每毫克粗酶液蛋白質(zhì)的酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 S.inulinus Y2-8 pfk基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

以S.inulinus Y2-8基因組為模板，擴(kuò)增pfk基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在960 bp左右有一明顯條帶(圖1(a))，與預(yù)計(jì)結(jié)果一致。構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)抗性篩選和雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示(圖1(b))重組質(zhì)粒在960 bp左右比空載體pSE380多出一條帶，與插入的外源基因pfk大小一致，表明成功獲得重組質(zhì)粒pSE-pfk，重組菌命名為E-pSE-pfk。

2.2 S.inulinus Y2-8 pfk基因的生物信息學(xué)分析

測(cè)序分析表明，Y2-8的pfk為960 bp，編碼319個(gè)氨基酸。將該DNA序列提交GenBank，所得登錄號(hào)為KC415135。序列比對(duì)分析表明，Y2-8的pfk的核苷酸序列與來(lái)源于S.inulunus CASD基因組推測(cè)的pfk基因(ZP_09714106)的核苷酸序列相似性為100%。BLAST比對(duì)顯示，S.inulinus Y2-8的PFK氨基酸序列與來(lái)源于Geobacillus stearothermophilus的PFK(BAA02405)具有最高的相似性，為 71%［11］，與其他來(lái)源的芽胞桿菌屬的PFK均具有較高的氨基酸相似度(71% ～67%)［8］。

圖1 S.inulinus Y2-8 pfk的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product of pfk gene from S.inulinus Y2-8 and enzymatic result of recombinant plasmids

將S.inulinus Y2-8 PFK與9種不同來(lái)源典型乳酸菌PFK的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，分析其活性位點(diǎn)(圖2)。由圖2可知:S.inulinus Y2-8 PFK與其他乳酸菌的PFK均具有較高的氨基酸相似性(55%～71%)。根據(jù)來(lái)源于 G.stearothermophilus和Lactobacillus bulgaricus PFK 的活性位點(diǎn)［8］，可以發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源PFK的底物F-6-P和MgATP的結(jié)合位點(diǎn)是嚴(yán)格保守的。但是，不同乳酸菌PFK的變構(gòu)效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)存在著一定的差異，如來(lái)源于芽胞桿菌屬PFK的E187和R211在L.bulgaricus PFK突變成D187和S211，而這很可能造成變構(gòu)效應(yīng)的差異。酶動(dòng)力學(xué)和晶體結(jié)構(gòu)解析表明，L.bulgaricus PFK對(duì)變構(gòu)效應(yīng)物MgADP和PEP的親和力明顯低于G.stearothermophilus PFK。S.inulinus Y2-8 PFK的變構(gòu)效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)與來(lái)源于芽胞桿菌屬PFK具有很高的保守性，可以預(yù)測(cè)，兩者的變構(gòu)效應(yīng)具有很大的相似性。但是S.inulinus是一種古老的細(xì)菌，有著較為保守的進(jìn)化過(guò)程。筆者前期在對(duì)葡萄糖磷酸化關(guān)鍵酶葡萄糖激酶(GLK)的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然該GLK與來(lái)源芽胞桿菌屬GLK具有嚴(yán)格保守的活性位點(diǎn)，但是S.inulinus的GLK具有與眾不同的廣泛底物特異性［12］。因此，對(duì)S.inulinus PFK變構(gòu)效應(yīng)機(jī)制的細(xì)致解析，將是筆者下一階段的工作目標(biāo)之一。

圖2 S.inulinus PFK與9種不同來(lái)源乳酸菌的PFK的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment of amino acid sequences of PFK from S.inulinus with those from different lactic acid bacteria

2.3 PFK在重組菌E-pSE-pfk中的誘導(dǎo)表達(dá)

重組菌E-pSE-pfk在加入0.5 mmol/L IPTG后在30℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，超聲破碎上清液的PFK比酶活為1.02 U/mg，而空宿主的比酶活為0.16 U/mg，SDSPAGE電泳分析結(jié)果見圖3。由圖3可知:重組菌在3.4×104左右處有明顯的條帶，與理論計(jì)算的相對(duì)分子質(zhì)量3.438×104一致，而含pSE380空質(zhì)粒對(duì)照菌株中未見明顯條帶。這說(shuō)明，S.inulinus pfk在E.coli中得到了成功表達(dá)。但是由于包涵體的存在導(dǎo)致可溶性蛋白含量較低，PFK比酶活較低，因此，需要對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 重組菌誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.4.1 誘導(dǎo)溫度的影響

按照1.2.4接種重組菌 E-pSE-pfk，加入0.5 mmol/L IPTG后誘導(dǎo)6 h，考察溫度對(duì)重組菌的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知:隨著溫度的降低，PFK比酶活反而在逐漸升高，在20℃條件下誘導(dǎo)PFK比酶活有大幅度提高，達(dá)到最高值3.72 U/mg。SDS-PAGE分析也表明，隨著溫度的降低，可溶性的PFK蛋白含量在明顯增高。但是，當(dāng)溫度低于20℃時(shí)，蛋白含量和PFK比酶活反而降低。

2.4.2 IPTG誘導(dǎo)劑濃度的影響

按照1.2.4接種重組菌E-pSE-pfk，20℃誘導(dǎo)6 h，考察不同IPTG濃度對(duì)重組菌的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知:隨著IPTG濃度的升高，PFK比酶活顯著提高，在0.1 mmol/L IPTG時(shí)，重組菌PFK比酶活達(dá)到最高值，4.31 U/mg。但是當(dāng)IPTG濃度大于0.1 mmol/L，PFK比酶活反而有所下降。

2.4.3 IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的影響

按照1.2.4接種重組菌E-pSE-pfk，加入0.1 mmol/L IPTG，20℃時(shí)誘導(dǎo)，考察不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知:隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PFK比酶活隨之升高，在誘導(dǎo)12 h后，PFK比酶活達(dá)到最高，為4.89 U/mg。但是，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過(guò)12 h，PFK酶活有所降低。這有可能是由于細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入衰亡期，發(fā)酵液里存在一些使表達(dá)的重組蛋白降解的因素，導(dǎo)致酶活力下降。

3 SDS-PAGE分析不同誘導(dǎo)溫度下重組菌的PFK表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis of PFK expression levels of recombinant stain induced at different temperatures

圖4 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌PFK比酶活的影響Fig.4 Effects of temperature on PFK specific activity of recombinant stain

圖5 IPTG對(duì)重組菌PFK比酶活的影響Fig.5 Effects of IPTG concentration on PFK specific activity of recombinant stain

圖6 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌PFK比酶活的影響Fig.6 Effects of induction time on PFK specific activity of recombinant stain

大腸桿菌是表達(dá)外源蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)，而實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，宿主與載體以及誘導(dǎo)方法的選擇至關(guān)重要［13］。筆者在前期采用pET系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，目的蛋白受T7強(qiáng)啟動(dòng)子控制而過(guò)量表達(dá)，不能自發(fā)折疊卷曲，形成了不具生物活性的包涵體［13］。pSE380是也是常用的表達(dá)載體，其啟動(dòng)子Ptrc表達(dá)活性雖強(qiáng)，但是不容易形成包涵體，對(duì)保持酶活力非常有利［14］。在今后的研究中，可以采用帶組氨酸標(biāo)簽的pSE380表達(dá)載體，方便進(jìn)行鎳柱親和層析純化而獲得電泳純的目的蛋白。

經(jīng)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，重組菌E-pSE-pfk在加入0.1 mmol/L IPTG后，在20℃誘導(dǎo)12 h，粗酶液的PFK比酶活可達(dá)4.89 U/mg，比優(yōu)化前提高了4.79倍，為后續(xù)的蛋白純化以及活性研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。優(yōu)化結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間都對(duì)比酶活有一定的影響，其中誘導(dǎo)溫度對(duì)可溶性酶表達(dá)量的影響最大。低溫條件極大地增加了可溶性活性蛋白的含量，這可能是由于低溫能降低蛋白質(zhì)合成的速率，改變蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)，從而導(dǎo)致正確折疊的蛋白增加［13］。

3 結(jié)論

以D-乳酸高產(chǎn)菌S.inulinus Y2-8基因組DNA為模板，獲得磷酸果糖激酶基因，通過(guò)與不同來(lái)源乳酸菌PFK氨基酸序列的比對(duì)，表明其具有保守的底物結(jié)合位點(diǎn)和不同的效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步通過(guò)pSE380表達(dá)系統(tǒng)和低溫誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)來(lái)源于S.inulinus的PFK在大腸桿菌中的可溶性異源表達(dá)。誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，重組菌PFK的比酶活可達(dá)4.89 U/mg，為進(jìn)一步研究其變構(gòu)調(diào)控性質(zhì)和高產(chǎn)基因工程菌的構(gòu)建提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］ Xu H，Teng C Q，Yu M H.Improvements of thermal property and crystallization behavior of PLLA-based multiblock copolymer by forming stereocomplex with PDLA oligomer［J］.Polymer，2006，47:3922-3928.

［2］ 許婷婷，柏中中，何冰芳.D-乳酸制備研究進(jìn)展［J］.化工進(jìn)展，2009，28(6):991-996.

［3］ Xu T T，Bai Z Z，Wang L J，et.al.Breeding of D(-)-lactic acid high producing strain by low-energy ion implantation and preliminary analysis of related metabolism［J］.Appl Biochem Biotechnol，2010，160:314-321.

［4］ 錢志良，勞韓章，沈永喜，等.菊糖芽孢乳桿菌DS 2-18中試規(guī)模的 D-乳酸發(fā)酵研究［J］.工業(yè)微生物，2011，41(5):73-75.

［5］ Fothergill-Gilmore L A，Michels P A.Evolution of glycolysis［J］.Prog Biophys Mol Biol，1993，59:105-235.

［6］ Liu D，Chen Y，Li A，et al.Adaptation of glycolysis and growth to acetate in Sporolactobacillussp.Y2-8［J］.ApplBiochem Biotechnol，2012，168:455-463.

［7］ Andersen H W，Solem C，Hammer K.Two fold reduction of phosphofructokinase activity in Lactococcus lactis results in strong decreases in growth rate and in glycolytic flux［J］.J Bacteriol，2001，183:3458-3467.

［8］ Paricharttanakul N M，Ye S，Menefee A L et.al.Kinetic and structural characterization of phosphofructokinase from Lactobacillus bulgaricus［J］. Biochemistry， 2005， 44:15280-15286.

［9］ Sambrook J，F(xiàn)risch E F，Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual［M］.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

［10］ Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72:248-254.

［11］ Schirmer T，Evans P R.Structural basisof the allosteric behaviour of phosphofructokinase［J］.Nature，1990，343:140-145.

［12］ Zheng L，Bai Z Z，Xu T T，et.al.Glucokinase contributes to glucose phosphorylation in D-lactic acid production by Sporolactobacillus inulinus Y2-8［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2012，39:1685-1692.

［13］ 朱紅裕，李強(qiáng).外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)策略［J］.過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2006，6(1):150-155.

［14］ 齊向輝，孫儲(chǔ)鵬，何晨曦，等.一種帶有組氨酸標(biāo)簽的新型表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用［J］.生物技術(shù)，2010，20(6):52-54.