袁紹鵬，白金葉，玄玲玲，侯琦

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥物研究所，新藥作用機(jī)制研究與藥效評價北京市重點實驗室，北京 100050

哮喘是一種以氣道慢性炎癥為病理基礎(chǔ)的呼吸系統(tǒng)疾病，目前全世界約有3億人患有哮喘[1]。既往研究證明，T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子、趨化因子、細(xì)胞因子和多種蛋白酶是哮喘發(fā)病的主要原因[2]。近年來，中性粒細(xì)胞在哮喘氣道炎癥發(fā)生過程中的作用日益受到關(guān)注。中性粒細(xì)胞具有趨化、吞噬、產(chǎn)生氧自由基及釋放作用等功能。哮喘患者病情加重時，氣道中性粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多，不僅可導(dǎo)致急性哮喘的惡化，還可引起感染部位的炎癥，使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，引起病理性損害[3-4]。因此，通過抑制中性粒細(xì)胞在氣道炎癥微環(huán)境中的過度表達(dá)，對治療哮喘，特別是嚴(yán)重性哮喘，將發(fā)揮重要的功能。

白細(xì)胞介素6（IL-6）是重要的中性粒細(xì)胞調(diào)控因子，在中性粒細(xì)胞分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用。研究表明，哮喘患者肺內(nèi)IL-6的表達(dá)增加并促進(jìn)肺內(nèi)中性粒細(xì)胞活化和募集[5-6]。IL-6主要通過活化細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT3信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等功能。STAT3是STAT家族的重要成員，廣泛表達(dá)于多種類型的細(xì)胞及組織中，其最早作為IL-6信號轉(zhuǎn)遞中的急性反應(yīng)因子而被發(fā)現(xiàn)。此外，多種細(xì)胞因子和生長因子如干擾素、IL-11等也通過活化調(diào)控炎癥反應(yīng)[7-9]。目前，國內(nèi)外少見關(guān)于STAT3抑制劑改善和治療小鼠氣道炎癥的研究報道。FLLL31是在傳統(tǒng)中藥姜黃素單體基礎(chǔ)上，通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計并合成的新結(jié)構(gòu)化合物，能特異抑制STAT3磷酸化及活化，其生物學(xué)活性已在前期腫瘤研究中獲得證實[10]。但是，迄今國內(nèi)外未見有關(guān)FLLL31參與免疫調(diào)節(jié)，特別是氣道炎癥相關(guān)疾病治療的報道。在本研究中，我們擬研究STAT3小分子抑制劑類新結(jié)構(gòu)化合物FLLL31參與調(diào)控氣道炎癥的活性，探索其對小鼠氣道炎癥的改善活性，對氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤及趨化，相關(guān)炎癥因子如IL-6及炎癥細(xì)胞生物標(biāo)志物如淋巴細(xì)胞抗原6G（lymphocyte antigen 6G，Ly6G）等表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性BALB/c小鼠，18～20 g，SPF級，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供（合格證：SCXK-（京）2009-0007）。卵白蛋白（ovalbumin，OVA，Sigma公司）；FLLL31（純度≥98%，Sigma公司）；地塞米松（Sigma公司分裝）；Ly6G/Gr-1抗體（R&D公司）；小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒（BioLegend公司）。

1.2 動物模型的建立

雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，包括正常對照組（Control組）、模型對照組（OVA組）、地塞米松組（Dex組，1 mg/kg，腹腔注射）和FLLL31組（15 mg/kg，口服灌胃）。小鼠分別于第0 d和第14 d致敏，每只鼠腹腔注射20 μg OVA和2.25 mg Al（OH）3凝膠，F(xiàn)LLL31自致敏第24 d開始給藥，給藥周期為7 d。于第28、29、30 d以氣管滴入OVA方式進(jìn)行攻擊，攻擊前1 h給予受試化合物FLLL31及陽性藥地塞米松。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞及炎癥因子檢測 末次激發(fā)后24 h，切開小鼠頸部皮膚暴露氣管，插入灌流針，用1 mL預(yù)冷的PBS行肺部灌洗3次，吸出氣道灌流液，4℃、1000 r/min離心5 min，細(xì)胞沉淀用PBS緩沖液重懸，用全自動血球分析儀進(jìn)行細(xì)胞分類計數(shù)，離心上清以ELISA方法分析其中的IL-6含量。

1.3.2 小鼠肺部病理分析 取出小鼠完整的左側(cè)肺組織，用4%甲醛固定，石蠟包埋切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察對比各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.3.3 小鼠肺部過碘酸雪夫染色（periodic acid-Schiff stain，PAS染色）分析 取出小鼠完整的左側(cè)肺組織，用4%甲醛固定，石蠟包埋切片后進(jìn)行PAS染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織黏液物質(zhì)的分泌情況。

1.3.4 小鼠肺部免疫組化分析 取各組小鼠肺組織進(jìn)行免疫組化檢測，分析其中IL-6受體（IL-6R）、中性粒細(xì)胞生物標(biāo)志物L(fēng)y6G的表達(dá)水平變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺組織病理分析結(jié)果

小鼠肺部病理分析結(jié)果見圖1。與正常對照組相比，模型組小鼠肺間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤；與模型組相比，給予FLLL31治療后，小鼠肺間質(zhì)散在少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，提示FLLL31可有效抑制小鼠氣道炎癥細(xì)胞浸潤及侵襲。

2.2 支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計數(shù)

如圖2所示，與正常對照組相比，模型組小鼠灌洗液中炎癥相關(guān)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，F(xiàn)LLL31連續(xù)給藥7 d可明顯抑制小鼠氣道炎癥細(xì)胞的增加（P＜0.05）及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的升高（P＜0.05）。此外，氣道中的單核巨噬細(xì)胞的增加也被FLLL31明顯抑制（P＜0.05）。

2.3 小鼠肺組織PAS染色分析結(jié)果

小鼠肺組織PAS染色結(jié)果（圖3）顯示，與對照組相比，OVA致敏后，明顯增加小鼠肺組織內(nèi)黏液物質(zhì)的分泌；與模型組相比，給予FLLL31治療后，小鼠肺組織黏液物質(zhì)的分泌得到抑制和改善。

2.4 支氣管肺泡灌洗液炎癥因子表達(dá)量分析

我們進(jìn)一步檢測了小鼠肺部灌流液中IL-6的表達(dá)含量。如圖4所示，與正常對照組相比，模型組小鼠肺灌流液中炎癥因子IL-6的含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)LLL31治療組明顯抑制了小鼠氣道炎癥因子IL-6的表達(dá)（P＜0.05）。

2.5 免疫組化分析小鼠肺組織中IL-6R的表達(dá)

圖1 小鼠肺部病理檢測結(jié)果（100×）Control：正常組；OVA：模型組；Dex：地塞米松治療組；FLLL31：FLLL31治療組

圖2 小鼠肺部灌洗液中主要炎癥細(xì)胞分類計數(shù)

圖3 小鼠肺部PAS染色結(jié)果（100×）Control：正常組；OVA：模型組；Dex：地塞米松治療組；FLLL31：FLLL31治療組

小鼠肺部免疫組化分析結(jié)果（圖5）表明，與正常對照組相比，模型對照組小鼠肺部炎癥因子受體IL-6R的表達(dá)明顯升高；與模型組相比，F(xiàn)LLL31治療后，IL-6R的表達(dá)被顯著抑制，提示FLLL31能有效抑制小鼠氣道炎癥因子受體蛋白的表達(dá)。

2.6 免疫組化分析小鼠肺組織中Ly6G的表達(dá)

進(jìn)一步分析了小鼠肺組織中性粒細(xì)胞生物標(biāo)志物L(fēng)y6G的表達(dá)。免疫組化分析結(jié)果（圖6）表明，與正常對照組相比，模型對照組小鼠肺部Ly6G的表達(dá)明顯升高；與模型組相比，F(xiàn)LLL31治療后，Ly6G的表達(dá)被顯著抑制，提示FLLL31能有效抑制小鼠氣道中性粒細(xì)胞的招募和浸潤。

圖4 小鼠肺部灌洗液中炎癥因子IL-6含量檢測

圖5 免疫組化檢測分析小鼠肺部炎癥因子受體IL-6R表達(dá)（100×）Control：正常組；OVA：模型組；Dex：地塞米松治療組；FLLL31：FLLL31治療組FLLL31治療組

圖6 免疫組化檢測分析小鼠肺部Ly6G的表達(dá)（100×）Control：正常組；OVA：模型組；Dex：地塞米松治療組；FLLL31：FLLL31治療組

3 討論

既往認(rèn)為Th2型淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的增加是哮喘發(fā)病的重要原因，但I(xiàn)L-5等單克隆抗體藥物在哮喘患者臨床治療中未取得預(yù)期治療效果等結(jié)果，提示其他炎癥因子及炎癥細(xì)胞在哮喘發(fā)病過程中也可能發(fā)揮重要的作用[11]。近年來的研究證明，中性粒細(xì)胞在哮喘發(fā)生過程中，特別是嚴(yán)重性哮喘的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。除了重要的防御作用外，中性粒細(xì)胞可以引起感染部位的炎癥，使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，引起病理性損害。因此，通過抑制中性粒細(xì)胞在氣道炎癥微環(huán)境中的過度表達(dá)，對治療哮喘，特別是嚴(yán)重性哮喘，將發(fā)揮重要的功能[12-13]。

國際上已有STAT3小分子抑制劑治療哮喘的相關(guān)研究報道[14]，但還未見FLLL31用于免疫抑制，特別是氣道炎癥相關(guān)疾病治療的報道。我們在既往研究中證實，F(xiàn)LLL31能特異抑制炎癥細(xì)胞STAT3通路活化，阻斷TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎癥因子的表達(dá)分泌，并且在體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)動物模型中表現(xiàn)出較好的免疫抑制活性。在本研究中，我們進(jìn)一步證明FLLL31可以有效抑制OVA致小鼠氣道炎癥發(fā)生，對于緩解氣道炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥因子表達(dá)具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性。

IL-6是重要的炎癥因子，在哮喘氣道炎癥樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用，STAT3是IL-6在細(xì)胞內(nèi)主要的信號調(diào)控通路之一[8]。哮喘患者肺內(nèi)IL-6的表達(dá)增加促進(jìn)肺內(nèi)炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞的活化和募集。 我們既往研究證明FLLL31能夠抑制炎癥細(xì)胞IL-6的表達(dá)和分泌。本研究中，我們證明FLLL31能夠抑制小鼠氣道灌流液IL-6及其受體IL-6R的表達(dá)，進(jìn)一步證明了IL-6在小鼠氣道炎癥發(fā)病過程中的重要作用。

此外，STAT3對于Th17淋巴細(xì)胞的分化具有關(guān)鍵的調(diào)控功能，能夠促進(jìn)炎癥因子IL-17的分泌和表達(dá)[15-16]，而IL-17通過調(diào)控氣道微環(huán)境中的結(jié)構(gòu)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化及調(diào)控因子的表達(dá)和分泌，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的招募、黏附及浸潤[17-18]。因此，F(xiàn)LLL31可能通過抑制小鼠氣道炎癥微環(huán)境中Th17等炎癥細(xì)胞分化和IL-17等炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮對小鼠氣道炎癥的抑制活性。

綜上所述，我們初步證明FLLL31能抑制小鼠肺部炎癥細(xì)胞與炎癥因子的表達(dá)，改善小鼠氣道炎癥發(fā)生，有較顯著的抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。這一發(fā)現(xiàn)對于研發(fā)哮喘治療藥物具有重要的理論和市場價值。

[1] Holt P G,Macaubas C,Stumbles P A,et al.The role of al?lergy in the development of asthma[J].Nature,1999,402:B12-17.

[2] Wenzel S E.Asthma phenotypes:the evolution from clinical to molecular approaches[J].Nat Med,2012,18:716-725.

[3] Mantovani A,Cassatella M A,Costantini C,et al.Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immu?nity[J].Nat Rev,2011,11:519-531.

[4] Linden A,Laan M,Anderson G P.Neutrophils,interleukin-17A and lung disease[J].Eur Respir J,2005,25:159-172.

[5] Finkelman F D,Hogan S P,Hershey G K,et al.Importance ofcytokinesin murine allergic airway disease and human asthma[J].J Immunol,2010,184:1663-1674.

[6] Finotto S,Eigenbrod T,Karwot R,et al.Local blockade of IL-6R signaling induces lung CD4+T cell apoptosis in a mu?rine model of asthma via regulatory T cells[J].Int Immunol,2007,19:685-693.

[7] Paul B,Mishra V,Chaudhury B,et al.Status of Stat3 in an ovalbumin-induced mouse model of asthma:analysis of the role of Socs3 and IL-6[J].Int Arch Allergy Immunol,2009,148:99-108.

[8] Gao H,Ward P A.STAT3 and suppressor of cytokine signal?ing 3:potential targets in lung inflammatory responses[J].Exp Opin Ther Targets,2007,11:869-880.

[9] Simeone-Penney M C,Severgnini M,Tu P,et al.Airway epi?thelial STAT3 is required for allergic inflammation in a mu?rine model of asthma[J].J Immunol,2007,178:6191-6199.

[10]Lin L,Hutzen B,Zuo M,et al.Novel STAT3 phosphorylation inhibitors exhibit potent growth-suppressive activity in pancre?atic and breast cancer cells[J].Cancer Res,2010,70:2445-2454.

[11]Pavord I D.Non-eosinophilic asthma and the innate immune response[J].Thorax,2007,62:193-194.

[12]Lajoie S,Lewkowich I P,Suzuki Y,et al.Complement-medi?ated regulation of the IL-17A axis is a central genetic deter?minant of the severity of experimental allergic asthma[J].Nat Immunol,2010,11:928-935.

[13]Goplen N,Karim M Z,Liang Q,et al.Combined sensitiza?tion of mice to extracts of dust mite,ragweed,and Aspergil?lus species breaks through tolerance and establishes chronic features of asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2009,123:925-932.

[14]Matsunaga Y,Inoue H,Fukuyama S,et al.Effects of a Ja?nus kinase inhibitor,pyridone 6,on airway responses in a murine model of asthma[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,404:261-267.

[15]Tundwal K,Alam R.JAK and Src tyrosine kinase signaling in asthma[J].Front Biosci,2012,17:2107-2121.

[16]Yang X O,Panopoulos A D,Nurieva R,et al.STAT3 regu?lates cytokine-mediated generation of inflammatory helper T cells[J].J Biol Chem,2007,282:9358-9363.

[17]Park S J,Lee Y C.Interleukin-17 regulation:an attractive therapeutic approach for asthma[J].Resp Res,2010,11:78.

[18]Chang S H,Dong C.Signaling of interleukin-17 family cyto?kines in immunity and inflammation[J].Cell Signalling,2011,23:1069-1075.