于虹，王欣，，楊裔，陳萬榮，郭彥，周育森，高基民 ，寇志華

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071；2.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035

隨著臨床上廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑的應(yīng)用，各種侵入性診療技術(shù)的開展及HIV-1感染人群的日益增多，深部真菌感染的發(fā)病率自20世紀(jì)80年代以來上升了3～5倍[1]，在兒童中的感染報道也逐年增多[1-2]。真菌感染中以隱球菌感染最常見，其較高的病死率及呈上升趨勢的發(fā)病率已引起臨床醫(yī)師高度重視。隱球菌屬包括17個種和8個變種，其中新型隱球菌是主要的致病菌，包括新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）和格特隱球菌（C.gattii）。

新型隱球菌的致病力主要由其細(xì)胞壁的多糖莢膜所介導(dǎo)，莢膜相關(guān)蛋白是莢膜的必需組分[3-4]，包括CAP59[5]、CAP60[6]、CAP64[7]和 CAP10 等。繼 CAP59、CAP60、CAP64之后，CAP10于1999年被發(fā)現(xiàn)并報道，其編碼基因全長3150 bp，含3個內(nèi)含子，表達(dá)產(chǎn)物為包含640個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為73×103[8]，定位于細(xì)胞質(zhì)，是新型隱球菌侵襲力的重要因素，但其功能尚不十分清楚。生物信息學(xué)分析表明，CAP10的N端70～250殘基（aa）為主要致病菌新型隱球菌（血清型A、D、AD）的保守性片段[8]，在新型隱球菌感染診斷中可能具有重要的應(yīng)用價值。因此，我們選擇莢膜相關(guān)蛋白CAP10（70～250 aa）作為研制單抗的靶抗原，制備特異性抗CAP10抗體，同時對其進(jìn)行鑒定，為臨床新型隱球菌的檢測和血清型分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡BALB/c雌性小鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供；小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0為本室保存。HRP-山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司；ELISA顯色液A、B及終止液購自北京萬泰生物制藥公司；弗氏佐劑、免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒購自Sigma公司；PEG-1500購自Roche公司；HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基均購自北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司。

1.2 重組蛋白的制備與純化

[9]的方法，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)新型隱球菌抗原表位集中且保守性好的CAP10 70～250 aa片段（為與全長蛋白相區(qū)分，命名為CAP10-1），經(jīng)鎳柱純化、復(fù)性，測定濃度后保存于-20°C備用

1.3 動物免疫

取純化的重組蛋白與弗氏佐劑等體積混合、乳化，皮下注射途徑免疫6只6～8周齡BALB/c雌性小鼠，10 μg/只，共免疫3次，每次間隔2周，首次免疫使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑，融合前3 d用無佐劑純化蛋白10 μg加強(qiáng)免疫一次。首次免疫前和每次免疫后2周于尾靜脈取血分離血清，-70℃凍存，分別作為陰性對照和每次抗體效價檢測的血清標(biāo)本，用ELISA方法檢測血清抗體的效價。

1.4 雜交瘤細(xì)胞的融合及篩選

參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞融合與篩選。簡言之，無菌條件下取免疫小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，用PEG-1500按常規(guī)方法與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用含HAT的1640完全培養(yǎng)基置37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中；第4 d換液，7～10 d后以ELISA方法檢測培養(yǎng)上清有無抗體產(chǎn)生，篩選陽性孔；進(jìn)一步采用有限稀釋法對陽性克隆進(jìn)行連續(xù)3次的亞克隆，每次亞克隆采用含HT的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10 d，篩選出穩(wěn)定、高水平表達(dá)特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

1.5 腹水制備及效價測定

篩選出的高表達(dá)陽性細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞，用生理鹽水洗滌3次，并配制1×106/mL細(xì)胞懸液，腹腔接種于事先用石蠟油致敏的BALB/c雌性小鼠，0.5 mL/只，10～12 d 后開始采集腹水并離心分離，置-20℃保存；用純化的重組CAP10-1包被，采用間接ELISA法檢測腹水中的抗體效價。

1.6 單克隆抗體特異性鑒定

應(yīng)用ELISA方法，分別用重組CAP10-1、大腸桿菌裂解蛋白、商品化的莢膜相關(guān)蛋白CAP59等抗原進(jìn)行包被，以測定所制備單抗的特異性。以無關(guān)單抗腹水為陰性對照，HRP-山羊抗小鼠IgG為二抗，測定D450nm值，以D450nm≥2倍對照組D450nm平均值判斷為陽性。

1.7 單克隆抗體亞類鑒定

用Sigma公司的免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒經(jīng)間接ELISA鑒定制備的單克隆抗體的抗體亞類。以純化后的重組CAP10-1為靶抗原，一抗為雜交瘤細(xì)胞上清，二抗為IgG亞類鑒定試劑盒里的酶標(biāo)抗體（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、lambda、kappa），測定D450nm值。

1.8 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

用純化的CAP10-1以終濃度2 mg/mL包被酶標(biāo)板（Corning公司），50 μL/孔，置4℃過夜，次日用含10%小牛血清和0.05%Tween-20的PBS于37℃封閉1 h，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3次后加入稀釋至一定濃度的樣品（血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水），50 μL/孔，37℃孵育1 h，洗滌3次后加入1∶5000稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h，用PBST洗滌5次后TMB顯色，判斷結(jié)果。以D450nm≥2倍陰性對照D450nm平均值判斷為陽性。

2 結(jié)果

2.1 BALB/c小鼠免疫后抗CAP10抗體的效價

按照前述方法免疫小鼠，初免前和加強(qiáng)免疫后2周自尾靜脈取血分離血清，進(jìn)行間接ELISA檢測。從1∶4000進(jìn)行倍比稀釋，結(jié)果見圖1，加強(qiáng)免疫后血清抗體效價大于50萬。

2.2 雜交瘤細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞株的篩選

圖1 ELISA檢測重組Cap10-1免疫小鼠后血清抗體效價

選取血清抗體效價最高的1號小鼠制備脾細(xì)胞，將制備的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，3 d后觀察細(xì)胞融合效果；10 d后取上清液以間接ELISA進(jìn)行篩選，以純化的重組蛋白為靶抗原，挑選抗體效價高且單細(xì)胞集落的細(xì)胞株，共22株；將篩選的22株細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，采用間接ELISA篩選D450nm值較高且為單細(xì)胞集落的細(xì)胞株，共15株；將此15株細(xì)胞株再次亞克隆，進(jìn)行單細(xì)胞集落篩選，得到11株高特異分泌抗CAP10-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為抗CAP10-mAb-1～CAP10-mAb-11。11株細(xì)胞株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價的檢測

采用間接ELISA，用純化的重組蛋白包被，一抗為對11株雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)所收集的上清，二抗為HRP-山羊抗小鼠IgG，測定雜交瘤細(xì)胞上清的抗體效價，結(jié)果如圖2，11株雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清抗體效價最低為1280，最高大于40 960。

2.4 單克隆抗體的亞類鑒定

采用間接ELISA對篩選的11株細(xì)胞株進(jìn)行亞型分析，用純化蛋白包被，以細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，IgG亞類鑒定的酶標(biāo)為二抗。結(jié)果表明，制備的11株單抗均為IgG1亞型，輕鏈均為κ鏈。

2.5 抗CAP10單克隆抗體小鼠腹水的制備及抗體效價測定

將高表達(dá)的11株單克隆抗體細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后接種于BALB/c小鼠腹腔，10～12 d后收集腹水，離心取上清，按1∶2000進(jìn)行倍比稀釋后，用間接ELISA檢測腹水中的抗體效價，結(jié)果如圖3，11株單抗的效價均大于500 000。

2.6 抗體特異性鑒定

分別以純化的重組CAP10-1、大腸桿菌裂解蛋白和商品化莢膜相關(guān)蛋白CAP59為對照抗原進(jìn)行包被，采用間接ELISA對獲得的11株單克隆抗體進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果見圖4，11株單克隆抗體均只與重組CAP10-1反應(yīng)，與其他蛋白無交叉反應(yīng)。表明制備的單克隆抗體是針對莢膜相關(guān)蛋白CAP10的特異性單抗。

3 討論

CAP是新型隱球菌入侵人體、抵抗免疫系統(tǒng)、防御宿主清除的重要成分，是新型隱球菌重要的毒力分子，但其作用機(jī)制尚未完全揭示[3-7]。深入研究CAP的結(jié)構(gòu)、功能及其與隱球菌致病力的關(guān)系，有助于了解新型隱球菌的致病機(jī)制，為隱球菌病的治療提供新的思路，同時也為隱球菌病的診斷及轉(zhuǎn)歸提供評價指標(biāo)。制備高效價的抗體是檢測新基因表達(dá)和研究新基因功能的前提，目前國內(nèi)外尚無CAP10蛋白單克隆抗體制備的報道。研制高效、特異的抗CAP10的單克隆抗體，不但有助于進(jìn)一步探討其功能，對新型隱球菌的臨床診斷和血清分型也具有重要意義。

與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有純度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，是研究病原體致病機(jī)制、診斷和治療的重要工具。我們采用體內(nèi)誘生方法制備單克隆抗體，用純化的CAP10免疫BALB/c小鼠，當(dāng)小鼠抗體效價達(dá)到適當(dāng)水平時，經(jīng)ELISA檢測選取血清抗體效價最高的小鼠，取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞融合[10]。小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0是經(jīng)8－氮雜鳥嘌呤（8-azagunine，8-AG）誘導(dǎo)產(chǎn)生的，缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），利于融合細(xì)胞的篩選，且本身不分泌IgG鏈，有利于抗體同種型的鑒定。目前用于誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有病毒、化學(xué)試劑及電脈沖，其中聚乙二醇（PEG）為常用的誘導(dǎo)細(xì)胞融合的化學(xué)因子。PEG的相對分子質(zhì)量和濃度是影響融合效率的重要因素，一般在融合過程中選擇相對分子質(zhì)量為1000～4000的PEG，濃度為30%～50%時均可獲得最佳融合效果。但PEG可使細(xì)胞膜產(chǎn)生不穩(wěn)定性，有一定的毒性。本研究選取PEG-1500誘導(dǎo)融合因子，結(jié)果表明其融合率可達(dá)100%。

圖2 雜交瘤細(xì)胞上清效價檢測

圖3 腹水抗體效價測定

圖4 11株單抗的特異性分析

融合后，雜交瘤細(xì)胞因?yàn)槿旧w數(shù)較正常多一倍，細(xì)胞狀態(tài)不穩(wěn)定，在瘤細(xì)胞分裂時染色體的分配不平衡，可能會造成雜交瘤細(xì)胞在增殖過程中抗體分泌能力的丟失。為獲得穩(wěn)定表達(dá)的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，我們采用2次亞克隆的方法。首先，用間接ELISA檢測第一次融合的細(xì)胞上清，選擇D450nm值較高且培養(yǎng)孔中為單個細(xì)胞集落的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，從陽性分泌孔收集雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法使每孔只有一個細(xì)胞[11]。然后，對陽性分泌孔進(jìn)行2次亞克隆，收集雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)逐步稀釋，最后得到了11株穩(wěn)定分泌高特異性抗CAP10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。隨后，將11株雜交瘤細(xì)胞于腹腔注射BALB/c小鼠，獲得了含有單克隆抗體的腹水，間接ELISA檢測結(jié)果顯示每株單抗腹水的效價大于50萬，亞型鑒定表明11株雜交瘤細(xì)胞株都為IgG1，輕鏈為κ型[12]，而且11株單抗僅與重組CAP10-1特異性結(jié)合，與其他抗原無交叉反應(yīng)，說明針對該片段的單克隆抗體可用于新型隱球菌的致病機(jī)制研究，并可能用于新型隱球菌的檢測和分型?？笴AP10單克隆抗體的制備，為深入研究CAP10的生物學(xué)功能，建立新型隱球菌感染的診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

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