郭晶晶，于虹，楊裔，孫維來，肖文珺 ，郭彥 ，寇志華，周育森

1.中南大學 基礎醫(yī)學院，湖南 長沙 410000；2.軍事醫(yī)學科學院 微生物流行病研究所，病原生物學國家重點實驗室，北京 100071

活化相關分泌蛋白1（activation-associated se?creted protein-1，ASP-1）是盤尾絲蟲L3期分泌的一種重要蛋白[1]，在宿主體內具有免疫調節(jié)功能，可降低宿主的免疫應答[2-3]，起到免疫逃逸作用[4]，其相對分子質量為 24.9×103[5]。研究發(fā)現(xiàn)，ASP-1 無需佐劑就能誘導機體產生高水平的IgG抗體，包括IgG1、IgG2a類抗體，誘導的免疫應答具有Th1型優(yōu)勢[6]。ASP-1作為非毒素類生物佐劑，還可以增強多種形式的抗原，如蛋白抗原、多肽抗原或疫苗的免疫原性，能同時誘導體液免疫和細胞免疫[7-8]。ASP-1發(fā)揮佐劑活性的機制研究表明，ASP-1通過與抗原提呈細胞上的TLR2、TLR4結合，激活APC，進而誘導Th1型和Th2型細胞因子，包括IFN-γ、TNF-α，IL-5等分泌，發(fā)揮佐劑活性[9]。同時還發(fā)現(xiàn)ASP-1的免疫原性較強，在誘導機體產生自身抗體的情況下，其佐劑活性有所下降[10]。因此，降低ASP-1的免疫原性的同時保留其佐劑活性有重要意義，但目前ASP-1的佐劑活性功能區(qū)及作用機制尚不清楚。因此，研究ASP-1佐劑的活性功能區(qū)及作用機制，對于深入認識并應用這種新型佐劑具有重要意義。

單克隆抗體是系統(tǒng)研究ASP-1的佐劑活性功能區(qū)及發(fā)揮佐劑活性作用機制的重要工具，但目前國內外尚無ASP-1單克隆抗體，因此，制備ASP-1特異性單克隆抗體并明確其抗原結合域具有重要的應用價值。我們制備了5株能穩(wěn)定分泌抗ASP-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并用制備的單抗對ASP-1保守結構域進行了鑒定，為深入研究ASP-1佐劑活性功能域奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡BALB/c雌性小鼠由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供；小鼠骨髓瘤細胞系Sp2/0由本實驗室保存；甘油中保存的重組菌pQE30/M15/ASP-1、無關抗HA單抗及無關蛋白TF由本室提供；IPTG購自金科宏達公司；Ni-charged resin及內毒素鱟試劑檢測試劑盒購自金斯瑞公司；PEG-6000購自Roche公司；蛋白marker、蛋白定量試劑盒購自天根公司；鼠抗His抗體、HRP-山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋公司；ELISA顯色液A、B及終止液購自北京萬泰生物制藥公司；超敏發(fā)光液、PVDF膜購自MILLIPORE公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、HAT選擇培養(yǎng)基、1%HT培養(yǎng)液購自北京天潤善達科技有限公司；透析袋MD34購自北京瑞達恒輝公司；酶聯(lián)免疫檢測儀（ELx808）購自BioTek公司。

1.2 ASP-1重組蛋白的表達純化及鑒定

重組ASP-1的表達純化參照文獻進行[11]。利用梯度復性法，即6 mol/L尿素-2 mol/L尿素-PBS對目的蛋白進行復性，用Balford法測定蛋白濃度，對重組ASP-1進行內毒素檢測，即在分裝有100 μL鱟試劑溶液的試管中加入100 μL樣品，設立陰性對照（無內毒素水）、陽性對照（內毒素標準品），37℃恒溫器孵育60 min取出觀察結果，依據是否出現(xiàn)凝膠判斷是否為陽性。

1.3 抗ASP-1單克隆抗體雜交瘤細胞的制備、篩選及細胞培養(yǎng)上清抗體效價測定

取6只6～8周齡BALB/c雌性小鼠，不加佐劑免疫重組ASP-1（每只25 μg/次），每3周免疫1次，共免疫3次，用間接ELISA檢測至血清中抗ASP-1抗體效價達到106以上。

融合前1周復蘇小鼠骨髓瘤Sp2/0細胞，用含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細胞制得小鼠骨髓瘤細胞懸液，同時處死免疫小鼠，無菌取脾制得脾細胞懸液，待融合。

細胞融合采用常規(guī)方法進行[12]。融合前1 d取正常小鼠的腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞，取骨髓瘤Sp2/0細胞和免疫小鼠脾細胞，以PEG1500為融合劑進行融合，采用間接ELISA篩選雜交瘤細胞。將初步篩選得到的陽性細胞克隆株用有限稀釋法進行4次亞克隆，篩選出穩(wěn)定高表達單克隆抗體的特異性雜交瘤細胞株。用ASP-1包被，采用間接ELISA測定雜交瘤細胞株培養(yǎng)液上清中的抗體效價。

1.4 含單克隆抗體腹水的制備及效價測定

選擇擴大培養(yǎng)后狀態(tài)良好的亞克隆篩選出的高表達陽性細胞株凍存；復蘇凍存的雜交瘤細胞，10～15 d后收集處于對數(shù)生長期的細胞，用PBS洗滌3次，配成濃度為1×106/mL的細胞懸液，腹腔注射事先用液體石蠟致敏的BALB/c雌性小鼠，每只0.5 mL；10～12 d后小鼠腹部明顯膨大，采集腹水并離心，收集上清，置-70℃保存；用ASP-1蛋白包被，采用間接ELISA測定腹水效價。

1.5 單克隆抗體特性鑒定

1.5.1 單克隆抗體的特異性鑒定 用ASP-1蛋白包被抗原，以稀釋的腹水單抗為一抗、無關腹水抗HA單抗為陰性對照、HRP-羊抗小鼠IgG為二抗，測量D450nm值，＞2倍對照組D450nm平均值即判斷為陽性。

1.5.2 單克隆抗體的亞類鑒定 采用間接ELISA，以ASP-1重組蛋白為抗原，包被濃度為2 μg/mL，以收集的雜交瘤細胞上清為一抗，使用不同IgG亞類鑒定試劑盒里的酶標二抗（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA）進行鑒定。酶標儀檢測D450nm值，＞2倍對照組D450nm平均值即判斷為陽性。

1.6 單克隆抗體識別ASP-1保守結構域的鑒定

1.6.1 單抗識別8個保守結構域單肽的ELISA檢測 運用生物信息學技術對ASP-1全長序列進行預測分析，設計并合成了8個保守結構域的單肽。采用間接ELISA，以合成的ASP-1的8個單肽為包被抗原，包被濃度為5 μg/mL，以5株腹水為一抗，多克隆陽性血清及陰性血清分別為陽性、陰性對照，HRP-山羊抗小鼠IgG為二抗，檢測D450nm值，＞2倍對照組D450nm平均值即判斷為陽性。

1.6.2 單抗識別ASP-1及截短片段PRM的ELISA、Western印跡檢測 為了進一步驗證單抗識別的保守結構域，我們設計并構建了不含單抗識別保守結構域的ASP-1截短片段PRM，并采用間接ELISA及Western印跡檢測單抗是否識別不含保守結構域的PRM。ELISA分別以ASP-1和PRM為包被抗原，以免疫ASP-1的小鼠陽性血清為一抗，陰性血清為對照，驗證陽性血清是否和2種蛋白反應；然后以單抗為一抗、無關腹水抗HA單抗為陰性對照，驗證單抗對2種蛋白的識別，檢測D450nm值，判定標準同上。Western 印 跡 取 ASP-1、PRM 各 0.5 μg 進 行 12%SDS-PAGE，轉膜封閉后，以單抗為一抗，按1∶5000稀釋，以HRP-羊抗小鼠IgG為二抗，按1∶8000稀釋，用化學發(fā)光法進行發(fā)光檢測。

2 結果

2.1 重組ASP-1在原核系統(tǒng)中的表達純化及鑒定

重組ASP-1表達形式以包涵體為主。過柱純化后，經Alphalmager HP掃描軟件掃描，100 mmol/L咪唑洗脫液中目的蛋白占總條帶的99.1%，說明純度大于95%（圖1）。用梯度復性方法復性，收集蛋白后進行內毒素檢測，發(fā)現(xiàn)內毒素含量小于0.25 EU/mL，可作為抗原免疫小鼠。

2.2 穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株的篩選

采用雜交瘤技術及有限稀釋傳代法篩選穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株。融合后數(shù)日觀察，大多數(shù)孔出現(xiàn)透亮并聚集生長的細胞，篩選出21孔分泌陽性抗體的雜交瘤細胞，選取其中陽性值較高者進行有限稀釋。在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)220孔內有單個細胞集落，用間接ELISA篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)其中14個克隆為陽性克隆。亞克隆3次后擴大培養(yǎng)，獲得5株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株。收集細胞培養(yǎng)上清進行ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)4株雜交瘤細胞上清在1/320的稀釋度下，與ASP-1反應的D450nm值為1.5以上（上清3-1的D450nm值較低，為0.7，也判斷為陽性），而與無關蛋白TF反應時D450nm值均在0.1以下（圖2）。說明5株雜交瘤細胞上清僅與ASP-1發(fā)生特異性反應，不與無關蛋白TF反應。

圖1 ASP-1在大腸桿菌中的表達及純化

圖2 雜交瘤細胞上清抗體水平檢測結果ASP-1：5株單抗與ASP-1反應；無關蛋白：5株單抗與無關蛋白反應

2.3 含抗ASP-1單克隆抗體的腹水效價測定及亞類鑒定

復蘇5株雜交瘤細胞株，注射小鼠腹腔獲得5株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的腹水單抗。間接ELISA檢測結果顯示，5株單抗均能和ASP-1蛋白發(fā)生特異性結合，其中4株效價均在106以上，單抗3-1效價較低，為103，但仍為陽性（圖3）。進一步做亞類鑒定，5株單抗亞類均為IgG1，輕鏈均為λ型。

2.4 單克隆抗體識別區(qū)域的確定

ASP-1屬于CAP蛋白超家族，在空間結構上具有該家族的保守結構域[13]。為進一步研究ASP-1的佐劑活性功能區(qū)，對ASP-1全長序列進行了預測分析，設計并合成了8個保守結構域的單肽，其氨基酸序列及所屬功能域見表1。

ELISA檢測結果表明，5株單抗只識別單肽P2，對其余7個單肽均不識別。單肽P2（21～35 aa）和P3（29～43 aa）的重疊部分為29～35氨基酸殘基，重疊序列是RKKIVGQ，因此這5株單抗的識別區(qū)域是21～28氨基酸殘基的保守結構域GGKLTALE（圖4）。

為了進一步驗證單抗識別21～28氨基酸殘基的保守結構域，我們設計并構建了不含21～28 aa的ASP-1截短片段PRM。由于5株單抗均識別同一區(qū)域，故只用單抗1-1進行保守結構域的研究。ELISA檢測結果顯示，ASP-1多克隆陽性血清可以和ASP-1、PRM反應（圖5A），而單抗1-1不識別不含21～28 aa的PRM，但識別ASP-1（圖5B）。說明單抗1-1識別21～28氨基酸殘基的保守結構域。Western印跡及SDS-PAGE結果也證明了這一結論（圖5C、D）。

圖3 單克隆抗體腹水效價測定

表1 ASP-1 8個單肽的氨基酸序列及所屬功能域

圖4 不同單抗與8個單肽的反應檢測1～5：分別為單抗1-2、2-2、3-1、4-1和7-2；6：陽性血清

圖5 ELISA和Western印跡鑒定單抗1-1識別ASP-1的保守結構域

3 討論

ASP-1作為一種有應用前景的微生物來源的佐劑，具有直接與抗原混合即可發(fā)揮佐劑活性、誘導免疫反應具有Th1型偏倚、可降低聯(lián)合免疫疫苗的使用劑量、平衡免疫應答等特點。ASP-1屬CAP［cys?teine-rich secretory proteins（CRISPS），antigen 5（Ag5），and pathogenesis-related 1（Pr-1）］蛋白超家族。該家族的核心區(qū)域是一個類似三明治的空間結構αβα，即3條反向平行的β折疊夾在2個α螺旋層面之間，其中一個α螺旋層面由2個平行的α螺旋構成，另一個層面由單獨的一條α螺旋構成[14-16]。由于ASP-1的免疫原性較強，產生自身抗體后會使佐劑活性下降，因此降低其免疫原性，同時保留其佐劑活性有重要意義。單抗作為系統(tǒng)研究ASP-1佐劑活性功能域的有效工具，可在鑒定ASP-1保守結構域的應用方面發(fā)揮重要作用。

本實驗選擇有限稀釋法進行亞克隆，因為該法簡單、易操作，易從細胞群中篩選遺傳穩(wěn)定且同源的細胞系。經過3次亞克隆后篩選出5株陽性克隆細胞株，上清效價在103以上。注射小鼠后獲得5株單抗腹水，除單抗3-1外，效價均在106以上，亞類均為IgG1，輕鏈均為λ型。最終獲得的5株單抗，抗體效價高，特異性好，但所得單抗數(shù)量少，且均識別21～28氨基酸殘基的保守結構域。經Lasergene軟件的Protean分析，發(fā)現(xiàn)ASP-1的21～28氨基酸殘基是B細胞優(yōu)勢表位，在不加佐劑條件下機體產生的抗體主要針對該表位。

由于5株單抗均識別同一區(qū)域，故只應用單抗1-1進行了保守結構域的研究，分別與ASP-1、不含21～28 aa保守結構域的PRM蛋白進行ELISA，結果顯示在ASP-1多克隆抗體血清可識別ASP-1及PRM的情況下，單抗1-1不識別PRM，但識別ASP-1。進一步驗證了單抗1-1識別ASP-1上21～28氨基酸殘基的保守性結構域GGKLTALE。

綜上，ASP-1單抗的制備，為深入研究ASP-1佐劑活性功能域及其發(fā)揮佐劑活性的作用機制奠定了基礎。

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