李國輝，高劍平，丁重陽，劉元法，張 梁，顧正華，石貴陽，章克昌

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122;2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122;3.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，漳州 363000;4.江南大學(xué) 食品學(xué)院，無錫 214122)

三苯甲烷類染料廣泛地應(yīng)用于紡織印染、造紙和制革等工業(yè)中［1－3］，近期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)晶紫(圖1)等三苯甲烷類染料對動(dòng)物細(xì)胞具有毒害作用，因此有必要研究該類染料的脫色降解處理。一些物理和化學(xué)方法雖然也可以用于染料的處理，但由于其代價(jià)高、污泥產(chǎn)生量多和二次污染等原因，限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用［4－6］。利用微生物處理染料具有無污染、耗能低、代價(jià)小和可持續(xù)性好等優(yōu)點(diǎn)［7］，因此篩選出對三苯甲烷類染料具有降解脫色能力的微生物，研究微生物降解染料的機(jī)制，對三苯甲烷類染料污染治理具有重要意義。

諸多微生物都具有降解脫色三苯甲烷類染料的能力，如細(xì)菌 Agrobacterium radiobacter MTCC 8161［8］和 Bacillus cereus DC11［9］完全脫色 10 mg/L的結(jié)晶紫分別需要8和24 h，絲狀真菌 Trametes sp.SQ01 6 d內(nèi)可脫色20 mg/L結(jié)晶紫30%以上［10］，酵母 Saccharomyces cerevisiae MTCC 463 在7 h內(nèi)可脫色100 mg/L孔雀石綠85%以上［7］。在細(xì)菌、酵母和絲狀真菌中，酵母脫色三苯甲烷染料的能力較強(qiáng)，但是到目前為止，利用酵母脫色三苯甲烷類染料的研究較少，因此考慮篩選酵母來脫色三苯甲烷類染料。

筆者在煙梗樣品中分離篩選獲得1株高效脫色結(jié)晶紫的菌株，經(jīng)ITS-5.8S rDNA鑒定后發(fā)現(xiàn)該菌株為膠紅酵母。在初步確定脫色機(jī)理后，考察不同培養(yǎng)條件對膠紅酵母降解脫色結(jié)晶紫的影響，以期為其在生物降解化工廢水方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖1 3種三苯甲烷染料的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of three triphenylmethane dyes

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)JB401，篩選自四川地區(qū)產(chǎn)煙梗中。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):NaCl 5，酵母膏5，蛋白胨10;pH 7。

脫色培養(yǎng)基(g/L):NaCl 5，酵母膏5，蛋白胨10，結(jié)晶紫0.05;pH 7。

以上培養(yǎng)基均在115℃下滅菌20 min，斜面在30℃下培養(yǎng)48 h后放入4℃冰箱保存，使用時(shí)用接種環(huán)取1環(huán)菌放入種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h后待用。

1.2 方法

1.2.1 脫色微生物的分離篩選與鑒定

稱取2 g煙梗樣品，加入98 mL無菌生理鹽水，放入250 mL無菌三角瓶中，在30℃、150 r/min的搖床上培養(yǎng)1 h后，將培養(yǎng)液分別稀釋104、105或106倍后涂布在水溶苯胺藍(lán)平板上，并通過連續(xù)的分離純化篩選出能夠產(chǎn)生穩(wěn)定、明顯、較大透明圈的菌落(透明圈直徑與菌落直徑比值越大越好)，斜面保藏。

將斜面保藏的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)，24 h后分別加入不同濃度的結(jié)晶紫，通過測定不同菌株對結(jié)晶紫的脫色率，從中篩選出脫色能力優(yōu)良的菌株，保藏后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

按照Guillamm等［11］的方法對篩選得到的菌株進(jìn)行ITS-5.8S rDNA序列擴(kuò)增，所用引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。將 PCR產(chǎn)物連接到載體pMD18T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，提取質(zhì)粒，擴(kuò)增得到的ITS-5.8S rRNA基因利用ABI 3130 DNA自動(dòng)序列分析儀在上海生工生物工程公司進(jìn)行測序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索進(jìn)行同源性分析。最后利用ClustalX和Mega 5軟件制作進(jìn)化樹。

1.2.2 全波長掃描

統(tǒng)計(jì)并記錄所有患者診斷結(jié)果，比較CT掃描，增強(qiáng)MRI的診斷效能，計(jì)算CT掃描和增強(qiáng)MRI以及兩者聯(lián)合應(yīng)用診斷的、敏感度、特異度和準(zhǔn)確性。

收集膠紅酵母脫色完全后的結(jié)晶紫培養(yǎng)液，8 000 r/min離心20 min去除沉淀，上清液中加入等體積乙酸乙酯萃取，用無水Na2SO4干燥后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，獲得的結(jié)晶用少量色譜級甲醇溶解，使其終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，對照為不加入膠紅酵母的結(jié)晶紫培養(yǎng)基［12］，對脫色前后的染料在200～900 nm波長范圍進(jìn)行掃描，獲取的數(shù)據(jù)用UV-solutions1.2(日立集團(tuán))處理。

1.2.3 脫色實(shí)驗(yàn)

將生長24 h的種子按2%比例接種于脫色培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后，加入50 mg/L結(jié)晶紫，每隔1 h取出一定量的樣品，與無水乙醇按體積比1∶2的比例(V(樣品)∶V(無水乙醇))混勻后，12 000 r/min離心5 min，利用分光光度法在染料的最大吸收峰處測定上清液中剩余染料的含量，并以不接種的染料培養(yǎng)基作為對照來測定染料的脫色率［13－14］。每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，脫色率按式(1)來計(jì)算。

式中:I為對照在最大吸收峰處的吸光值;F為某一時(shí)刻樣品在最大吸收峰處的吸光值。

在此條件下，依次分別對pH 4～11、溫度(20～45)℃、接種量0.1% ～8%、培養(yǎng)方式(搖床和靜置)、初始染料質(zhì)量濃度(25～200)mg/L進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定膠紅酵母對結(jié)晶紫脫色的最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫色微生物的分離篩選與鑒定

從煙梗樣品中一共篩選到20株能夠在苯胺藍(lán)平板上產(chǎn)生透明圈的微生物，復(fù)篩后發(fā)現(xiàn)其中4株可以明顯降解結(jié)晶紫，4株中菌株JB401脫色效果最好，因此以JB401為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

經(jīng)過ITS-5.8S rDNA序列測定及GenBank數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果見圖2。由圖2可知:菌株 JB401與Rhodotorula mucilaginosa strain ATCC 66034(EU853846.1)相似性達(dá)到100%，由紅酵母屬ITS-5.8S rDNA序列構(gòu)建的N-J型進(jìn)進(jìn)化樹中(圖2)，菌株JB401與R.mucilaginosa strain ATCC 66034(EU853846.1)和 R.mucilaginosaCBS9078(AF444655.1)親緣關(guān)系最近，因此命名為Rhodotorula mucilaginosa JB401。

圖2 JB401系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of JB401

2.2 全波長掃描分析

利用膠紅酵母對結(jié)晶紫脫色后，將培養(yǎng)液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖3。由圖3可知:在589 nm處的最大吸收峰 λmax消失。而 Lee等［15］利用Pseudomonas otitidis WL-13降解結(jié)晶紫時(shí)發(fā)現(xiàn)，離心后上清液為無色，而菌體沉淀為紫色，認(rèn)為該菌株對結(jié)晶紫的脫色主要是菌體的吸附作用。在本實(shí)驗(yàn)中，脫色后離心得到的菌體沉淀不顯紫色，同時(shí)結(jié)晶紫脫色后在紫外區(qū)形成諸多小峰，表明有新的小分子產(chǎn)物生成，因此說明膠紅酵母對結(jié)晶紫的脫色并不是由于膠紅酵母的菌體吸附作用，而是由菌體的降解作用引起的。類似結(jié)果在Staphylococcus epidermidis降解結(jié)晶紫、孔雀石綠等三苯甲烷類染料過 程 中 也 有 報(bào) 道［16－17］。 此 外，Agrobacterium radiobacter MTCC 8161可利用漆酶的脫甲基和去苯環(huán)能力作用于結(jié)晶紫［8］，使之分解為多種小分子物質(zhì)，并在全波長掃描中產(chǎn)生新峰［18］，這一現(xiàn)象也與R.mucilaginosa JB401降解結(jié)晶紫相似。

圖3 全波長掃描結(jié)晶紫降解前后變化Fig.3 UV-VIS spectral analysis before and after crystal violet degradation

2.3 初始pH對膠紅酵母脫色的影響

圖4為初始pH對膠紅酵母脫色的影響結(jié)果。由圖4可知:膠紅酵母對結(jié)晶紫的脫色效果在酸性范圍較好，在pH 4～7之間脫色率可以保持在86%以上，其中pH 5時(shí)脫色率最高，分別為94.08%。當(dāng)pH＞7時(shí)，隨pH的增加脫色率急劇降低，當(dāng)pH為10時(shí)脫色率僅為21.97%。

圖4 pH對結(jié)晶紫脫色的影響Fig.4 Effects of pH on decolorization of crystal violet

這與前人的研究結(jié)果不同，可能是因?yàn)椴煌奈⑸飳Σ煌娜玖厦撋淖钸mpH各有不同。如，黃孢原毛平革菌對甲基紫的最適脫色pH為4.5，pH增加或降低均對黃孢原毛平革菌的脫色產(chǎn)生明顯影響，當(dāng)pH從3增加到7時(shí)，黃孢原毛平革菌對甲基紫的脫色率降低了 75%［19］，Trametes sp.SQ01產(chǎn)生漆酶脫色Remazol Brilliant Blue R時(shí)，也得到了相似的結(jié)果［20］。由此可見，膠紅酵母在偏酸性pH范圍內(nèi)有較高的脫色能力，這一特點(diǎn)符合生物處理廢水的要求。

2.4 溫度對膠紅酵母脫色的影響

考察不同的溫度對結(jié)晶紫脫色影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知:在20和45℃時(shí)，膠紅酵母對結(jié)晶紫脫色率仍高于80%，分別為81.17%和85.50%;其中，在37℃時(shí)，脫色效率最高，達(dá)到93.10%。當(dāng)溫度低于37℃時(shí)，脫色率隨溫度升高逐漸升高，超過45℃后，隨溫度升高脫色率則下降。

Phanerochaete chrysosporium對結(jié)晶紫的最適脫色溫度是(35±1)℃，當(dāng)溫度升高或降低時(shí)，會(huì)影響到染料的脫色率，這可能是由于生成的過氧化物酶減少或者酶失活造成脫色能力的降低［19］。對于純化后的真菌漆酶也是如此，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度升高時(shí)，由于酶與底物間反應(yīng)速率加快導(dǎo)致單位時(shí)間內(nèi)脫色率升高，但是當(dāng)溫度超過一定值后，由于酶的失活引起脫色率降低［20］。

圖5 溫度對結(jié)晶紫脫色的影響Fig.5 Effects of temperature on decolorization of crystal violet

2.5 接種量對膠紅酵母脫色的影響

圖6為接種量對膠紅酵母脫色的影響結(jié)果。由圖6可知:當(dāng)接種量小于2%時(shí)，脫色效率均隨接種量的升高而升高;當(dāng)接種量為0.1%時(shí)，脫色率僅為23.44%;當(dāng)接種量為2%時(shí)，脫色率為90.13%;當(dāng)接種量大于等于2%時(shí)，結(jié)晶紫的脫色率保持穩(wěn)定，并保持在90%以上。

而在Candida krusei脫色過程中，最適接種量為5%;超過5%時(shí)并不會(huì)影響達(dá)到最大脫色率的時(shí)間;但小于5%時(shí)，達(dá)到最大脫色率的時(shí)間會(huì)有所延遲，如接種量為3%時(shí)，則延長了24 h［21］。這可能是由于當(dāng)接種量較少時(shí)，菌體量較少不足以產(chǎn)生足夠的酶來處理染料，且染料對菌體具有一定的毒性而抑制菌體生長，所以造成了脫色時(shí)間的延長。這一結(jié)果在利用Saccharomyces cerevisiae降解孔雀石綠的研究中也得到了證實(shí)［7］。

圖6 接種量對結(jié)晶紫脫色的影響Fig.6 Effects of inoculum ratio on decolorization of crystal violet

2.6 培養(yǎng)方式對膠紅酵母脫色的影響

考察不同培養(yǎng)方式對膠紅酵母脫色的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知:搖床培養(yǎng)時(shí)脫色效率較高。在靜置條件下，膠紅酵母培養(yǎng)4 h時(shí)脫色率達(dá)到91.85%;而搖床培養(yǎng)2 h后，脫色率即達(dá)90.00%。在脫色的前5 h，搖床脫色一直明顯優(yōu)于靜置脫色，但是5 h后二者幾乎無差異(圖7)。

圖7 培養(yǎng)方式對結(jié)晶紫脫色的影響Fig.7 Effects of culture condition on decolorization of crystal violet

Conway等［22］研究發(fā)現(xiàn)，幾乎未見利用酵母和絲狀真菌在厭氧條件下對染料進(jìn)行脫色，這可能是因?yàn)樵趨捬鯒l件下，菌體的生長和代謝都受到較大影響，進(jìn)而影響到染料的脫色和降解。然而，膠紅酵母在對結(jié)晶紫染料脫色時(shí)，對氧的要求不大，靜置條件下達(dá)到最大脫色率的時(shí)間僅比搖床條件下的延長了2 h，幾乎未受到影響，這一特性使其可適用于工業(yè)染料廢水處理中的各種復(fù)雜體系，并且不會(huì)影響染料廢水的脫色處理。

2.7 初始染料濃度對膠紅酵母脫色的影響

考察不同初始染料濃度對膠紅酵母脫色的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知:在14 h內(nèi)膠紅酵母對結(jié)晶紫的脫色率均達(dá)到90%以上。其中，對于25 mg/L的結(jié)晶紫，在2 h內(nèi)的脫色率就達(dá)94.46%，這和Candida krusei相似;對于200 mg/L的染料，二者都是在20 h左右達(dá)到最大脫色率［21］。由于染料對菌體具有一定的毒性，因此微生物對200 mg/L結(jié)晶紫的去除率通常低于40%［10，23］。膠紅酵母對不同濃度結(jié)晶紫的適應(yīng)性較強(qiáng)，在不同濃度條件下，結(jié)晶紫的脫色率都超過90%，而且耗時(shí)較短。工業(yè)染料廢水中染料濃度較高，因此膠紅酵母所具有的可降解不同濃度結(jié)晶紫的能力，使其適用于工業(yè)化處理染料廢水。

圖8 初始染料濃度對結(jié)晶紫脫色的影響Fig.8 Effects of initial dye concentration on decolorization of crystal violet

3 結(jié)論

通過分離篩選獲得1株具有降解結(jié)晶紫能力的膠紅酵母，通過全波長掃描證實(shí)其降解能力，后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膠紅酵母對溫度和pH均有較好的適應(yīng)性，對不同濃度結(jié)晶紫都可達(dá)到較高的脫色率。

在本文的研究基礎(chǔ)之上，下一步將圍繞膠紅酵母降解結(jié)晶紫的詳細(xì)過程進(jìn)行研究:①降解過程中涉及的脫色酶及其作用方式;②染料降解過程中產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，以及可能的降解代謝途徑;③染料降解前后的毒性變化，以期在生物降解化工廢水方面提供更好的支持。

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