李 冰 王 穎，2 徐炳政 張東杰

LI Bing 1 WANG Ying 1，2 XU Bing－zheng 1 ZHANG Dong－jie 1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China；2.National Coarse Cereals Engineering Research Center，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

金屬硫蛋白是一類(lèi)低分子量（2～7 k D）、富含半胱氨酸（20%～30%）的金屬結(jié)合蛋白，廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)，具有清除自由基、抗電離輻射、降低重金屬中毒、參與體內(nèi)微量元素代謝、延緩衰老等生物學(xué)功能［1，2］，被逐漸應(yīng)用到醫(yī)藥、化妝品、保健品和環(huán)境監(jiān)測(cè)［3］等領(lǐng)域中。

金屬硫蛋白的特殊功能已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者們［4－7］的廣泛關(guān)注，并有學(xué)者分別對(duì)馬腎、兔肝、鼠肝、鯉魚(yú)等動(dòng)物的主要組織進(jìn)行誘導(dǎo)提取分離得到金屬硫蛋白。研究表明［8］，一些金屬離子可誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，從而使菌體合成并積累類(lèi)金屬硫蛋白。與動(dòng)物源提取相比，通過(guò)微生物源誘導(dǎo)產(chǎn)生金屬硫蛋白具有來(lái)源廣、成本低、發(fā)酵周期短等優(yōu)點(diǎn)［9］。金屬硫蛋白是一類(lèi)具有活性的小分子蛋白，當(dāng)其原有的穩(wěn)定環(huán)境發(fā)生改變，很容易發(fā)生聚合而降低甚至失去其原有的生物活性。所以，在研究誘導(dǎo)酵母菌生產(chǎn)類(lèi)金屬硫蛋白的過(guò)程中，選擇適宜的提取方法和適宜的提取條件是非常重要的。Ovadia等［10］從吐根中提取生物堿，用超聲波提取30 min比用索氏提取5 h的堿量還多。Liu Yuanfa等［11］利用超聲波輔助提取蜂膠黃酮類(lèi)功能性物質(zhì)的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲波提取所采用的時(shí)間與傳統(tǒng)方法相比縮短了30 h以上，黃酮得率也較傳統(tǒng)方法要高。同樣作為胞內(nèi)產(chǎn)物的酵母源金屬硫蛋白，本研究擬采用超聲波輔助提取，以期利用超聲波產(chǎn)生的空化、振動(dòng)、粉碎、攪拌等綜合效應(yīng)得到快速、高得率的金屬硫蛋白提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 材料

釀酒酵母N－8：本課題組誘導(dǎo)分離自存菌株；

Tris：美國(guó)Sigma公司；

酵母菌金屬硫蛋白（MT）酶聯(lián)免疫分析試劑盒：上海勁馬生物科技有限公司；

其它試劑：均為分析純。

1.1.2 儀器

冷凍干燥機(jī)：ALPHA1－2 LD plus型，德國(guó)Christ公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK－S24型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

超聲波處理器：FS－450N型，上海生析超聲儀器有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：T6新世紀(jì)型，北京普析通用儀器有限公司；

臺(tái)式離心機(jī)：LD4－40型，北京京立離心機(jī)有限公司。

1.2 分析測(cè)定

1.2.1 金屬硫蛋白的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法［12］。

1.2.2 巰基活性的測(cè)定 采用簡(jiǎn)化的巰基試劑（DTNB）法［12］。

1.3 金屬硫蛋白的誘導(dǎo)合成

將保存菌種置于YPD活化培養(yǎng)基中（蛋白胨20 g／L，葡萄糖20 g／L，酵母膏10 g／L），30℃搖床培養(yǎng)24 h。再將活化液2 m L接種至100 m L YEPD誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（蛋白胨20 g／L，葡萄糖20 g／L，酵母膏10 g／L，CuCl20.7 mmol／L），30℃搖床誘導(dǎo)培養(yǎng)62 h。以3 000 r／min的速度離心15 min收集菌體。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 料液比對(duì)提取工藝的影響 將菌體與0.05 mol／L p H 8.6的Tris—HCl緩沖液分別以1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（m∶V）比例混勻，在300 W下超聲處理30 min，充分混勻后，3 000 r／min離心25 min。上清液于80℃下恒溫處理8 min，迅速冷卻，3 000 r／min離心25 min，取上清液，凍干備用。以巰基活性為指標(biāo)，以金屬硫蛋白含量做參考。

1.4.2 超聲波輔助提取時(shí)間對(duì)提取工藝的影響 將菌體與0.05 mol／L p H 8.6的Tris－HCl緩沖液以1∶15（m∶V）比例混勻，在300 W 超聲強(qiáng)度下分別提取10，20，30，40，50 min，充分混勻后3 000 r／min離心25 min。上清液于80℃下恒溫處理8 min，冷卻后混勻，3 000 r／min離心25 min，取上清液，凍干備用。以巰基活性為指標(biāo)，以金屬硫蛋白含量做參考。

1.4.3 超聲波提取強(qiáng)度對(duì)提取工藝的影響 將菌體與0.05 mol／L p H 8.6的 Tris—HCl緩沖液以1∶15（m∶V）比例混勻，分別在100，200，300，400，500 W 超聲強(qiáng)度下提取30 min，充分混勻后3 000 r／min離心25 min。上清液于80℃下恒溫處理8 min，冷卻后混勻，3 000 r／min離心25 min，取上清液，凍干備用。以巰基活性為指標(biāo)，以金屬硫蛋白含量做參考。

1.4.4 熱變性時(shí)間對(duì)提取工藝的影響 將菌體與0.05 mol／L p H 8.6的 Tris—HCl緩沖液分別以1∶15（m∶V）比例混勻，在300 W超聲強(qiáng)度下提取30 min，充分混勻后3 000 r／min離心25 min。上清液分別于80℃下恒溫進(jìn)行4，6，8，10，12 min的熱處理，冷卻后混勻，3 000 r／min離心25 min，取上清液，凍干備用。以巰基活性為指標(biāo)，以金屬硫蛋白含量做參考。

1.5 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［13］，以粗提液巰基活性為指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，應(yīng)用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比的選擇 由圖1可知，隨著提取液的增加，粗提液的巰基活性和金屬硫蛋白含量明顯提高。這時(shí)大量的提取液使酵母菌細(xì)胞分散更均勻，破壁率提高。但當(dāng)料液比達(dá)到1∶15（m∶V）時(shí)，隨著提取液的增多，粗提液的巰基活性和金屬硫蛋白含量增大不顯著。為了降低成本和減少后續(xù)濃縮工作量，綜合考慮，選取最適超聲提取料液比為1∶15（m∶V）。

圖1 料液比對(duì)超聲提取率的影響Figure 1 Effect of the ratio of material to extractant on ultrasonic extraction rate

2.1.2 超聲提取時(shí)間的選擇 由圖2可知，隨著超聲提取時(shí)間的增加，提取液的巰基活性和金屬硫蛋白含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在30 min時(shí)達(dá)到最大。短時(shí)間的提取，酵母細(xì)胞破壁不完全，長(zhǎng)時(shí)間提取，容易導(dǎo)致巰基被破壞。故選取最適提取時(shí)間為30 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)超聲提取率的影響Figure 2 Effect of the the extraction rate on ultrasonic extraction time

2.1.3 超聲提取強(qiáng)度的選擇 由圖3可知，隨著提取功率的增大，粗提取液的巰基活性和金屬硫蛋白含量也隨之增大，到300 W時(shí)達(dá)到最大。之后隨著提取強(qiáng)度的增大，粗提液中的巰基活性和金屬硫蛋白含量平緩下降。綜合考慮，選擇300 W為最適提取強(qiáng)度。

圖3 提取強(qiáng)度對(duì)超聲提取率的影響Figure 3 Effect of the extraction rate on ultrasonic power

2.1.4 熱處理時(shí)間的選擇 金屬硫蛋白由于其特殊的堅(jiān)固構(gòu)象而具有一定的熱穩(wěn)定性，短時(shí)間的熱處理不會(huì)影響金屬硫蛋白的活性。80℃加熱處理是為了在最低限度破壞金屬硫蛋白的條件下使其它雜蛋白變性失活，為測(cè)定和下一步純化提供方便。

由圖4可知，加熱少于8 min對(duì)粗提液的巰基活性和金屬硫蛋白含量影響都很小，超過(guò)8 min后，巰基活性和金屬硫蛋白含量呈快速下降趨勢(shì)。因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的高溫加熱會(huì)導(dǎo)致巰基不穩(wěn)定。所以80℃最適熱處理時(shí)間為8 min。

圖4 熱處理時(shí)間對(duì)提取率的影響Figure 4 Effect of the extraction rate on the time of thermal denaturation

2.2 中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.2.1 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)，得到超聲波輔助金屬硫蛋白的提取最佳因素條件為料液比1∶15（m∶V），提取時(shí)間30 min，超聲波功率300 W，水浴熱處理時(shí)間8 min。根據(jù)此條件設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Code of factors and levels

2.2.2 回歸模型的建立 根據(jù)中心組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表2），以料液比、提取時(shí)間、提取強(qiáng)度為自變量，以粗提液的巰基活性為因變量建立二次多元回歸方程：

由表3可知，此模型是極顯著的（P＜0.01），失擬項(xiàng)P＝0.146 185＞0.05，不顯著，模型的R2＝99.18%，說(shuō)明該模型響應(yīng)值的變化99.18%都來(lái)自所選的因素。可見(jiàn)，模型與試驗(yàn)值擬合較好，該模型可用于粗提液巰基活性的理論預(yù)測(cè)。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 2 Experimental design and results of central composition design

2.2.3 響應(yīng)面分析 為了更好地研究自變量因素變化與響應(yīng)值之間的規(guī)律，將自變量中的3個(gè)因素固定其中的一個(gè)變量，取為0水平，進(jìn)行降維分析，從而對(duì)其余兩因素間的交互作用對(duì)粗提液中巰基活性進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。

由圖5可知，因素A（料液比）對(duì)粗提液中巰基活性的影響最為顯著，所呈現(xiàn)的曲線較陡。相比之下，其它兩個(gè)因素提取強(qiáng)度與提取時(shí)間的曲線表現(xiàn)得較為緩和，影響較小。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)化后得到的工藝參數(shù)，修訂后做3組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，料液比為1∶16（m∶V），提取時(shí)間為32 min，提取強(qiáng)度為287 W，熱處理時(shí)間為8 min，進(jìn)行超聲波提取，測(cè)定其巰基活性。測(cè)得粗提液的巰基活性的平均值為0.162μmol／L，與理論值0.167μmol／L接近?？梢?jiàn)，該模型是可靠的。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

＊＊表示極顯著（P＜0.01），＊表示顯著（P＜0.05）。

來(lái)源 方差 自由度 均方 F值 P值 顯著性A 0.000 45 1 0.000 45 112.5 0.000 129 ＊＊B 0.000 018 1 0.000 018 4.5 0.087 359 C 0.000 018 1 0.000 018 4.5 0.087 359 A 2 0.001 667 1 0.001 667 416.826 9 0.000 1 ＊＊AB 0.000 049 1 0.000 049 12.25 0.017 284 ＊AC 9.00E－06 1 9.00E－06 2.25 0.193 904 B2 0.000 083 1 0.000 083 20.826 92 0.006 037 ＊＊BC 0.000 081 1 0.000 081 20.25 0.006 4 ＊＊C2 0.000 168 1 0.000 168 42.057 69 0.001 3 ＊＊回歸模型 0.002 418 9 0.000 269 67.159 26 0.000 111 ＊＊一次項(xiàng) 0.000 486 3 0.000 162 40.5 0.000 624 ＊＊二次項(xiàng) 0.001 793 3 0.000 598 149.394 4 0.000 1 ＊＊交互項(xiàng) 0.000 139 3 0.000 046 11.583 33 0.010 905 ＊總誤差 0.000 02 5 4.00E－06失擬項(xiàng) 0.000 018 3 6.00E－06 6 0.146 185純誤差 2.00E－06 2 1.00E－06總和 0.002 438 14

圖5 交互作用對(duì)粗提液中巰基活性的影響Figure 5 Effect of the crude extracts thiol activity on interaction

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行3因素3水平Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)超聲波輔助提取酵母源類(lèi)金屬硫蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到提取最佳工藝參數(shù)為料液比1∶16（m∶V），提取時(shí)間32 min，提取功率287 W，熱處理時(shí)間8 min。該條件下得到的金屬硫蛋白巰基活性達(dá)0.162μmol／L，提高了金屬硫蛋白的產(chǎn)量，縮短了提取時(shí)間，對(duì)今后的酵母源類(lèi)金屬硫蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

在金屬硫蛋白的提取過(guò)程中，料液比即提取液濃度對(duì)提取結(jié)果的影響是極顯著的（P＜0.01），高濃度的提取液不利于金屬硫蛋白的提取，濃度降低到一定程度后，金屬硫蛋白的含量變化不顯著。這與黨蕊葉等［14］報(bào)道的兔肝金屬硫蛋白在低濃度Tris—HCl緩沖液中更穩(wěn)定的結(jié)果相似。由于金屬硫蛋白具有強(qiáng)抗熱性［15］，所以將得到的粗提液于80℃水浴熱處理8 min，以消除雜蛋白尤其是含巰基蛋白對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，對(duì)后續(xù)的純化工藝也有積極的促進(jìn)作用。

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