劉 蕊 陳 敏 王 宏

LIU Rui 1 CHEN Min 1 WANG Hong 2

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310012；2.浙江凱勝生物藥業(yè)有限公司，浙江 蘭溪 321100）

（1.College of Food Science ＆ Bioengineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou，Zhejiang 310012，China；2.Zhejiang Chyszern Biological Pharmaceutical Co.，Ltd，Lanxi，Zhejiang 321100，China）

恩拉霉素（enramycin）是1966年由日本武田藥品工業(yè)株式會社研究員從日本兵庫縣西宮市的土壤中分離出來的一株殺真菌鏈霉菌Streptomyces fungicidious NO.B－5477產(chǎn)生的一種多肽類抗生素［1－3］，具有廣譜抗革蘭氏陽性菌特性和優(yōu)良的促生長性、改善飼料利用率的作用，且不易與其他抗生素產(chǎn)生交叉耐藥性［4］。目前，對于發(fā)酵法生產(chǎn)恩拉霉素，國內(nèi)外主要集中在高產(chǎn)菌種的選育、培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化方面的研究［5－7］。

恩拉霉素是胞內(nèi)產(chǎn)物，所以恩拉霉素生產(chǎn)菌的生物量對于恩拉霉素產(chǎn)量的提高至關(guān)重要。恩拉霉素的生產(chǎn)菌隸屬于鏈霉菌屬，是好氧微生物，它的生長和恩拉霉素的合成都需要大量的氧氣。但由于恩拉霉素發(fā)酵生產(chǎn)過程中使用的培養(yǎng)基固形物含量高，黏度大，生產(chǎn)過程中菌絲體易結(jié)團，導(dǎo)致發(fā)酵系統(tǒng)的溶氧速率較低。如果加大攪拌速率來增加溶氧量，則剪切力會增大，造成菌絲體的損傷，生產(chǎn)能力下降。因此在實驗室及企業(yè)工業(yè)化生產(chǎn)中供氧成為提高恩拉霉素產(chǎn)量的主要限制因素之一。

近年來不少研究機構(gòu)采用一些新方法來改善發(fā)酵過程中的氧傳遞問題，以提高細胞和產(chǎn)物濃度，如氧載體。有文獻［8－10］表明，加入氧載體，可利用氧氣在其中的高溶解度特性，將它們引入發(fā)酵液來降低傳質(zhì)阻力。氧載體發(fā)酵體系由于氧傳遞速度快，能耗低，氣泡生成少，剪切力小的特點，受到廣泛的應(yīng)用。通常使用的氧載體有：液態(tài)烷烴、油酸、甲苯、全氟化碳、豆油等［11－14］。本研究擬考察不同氧載體對恩拉霉素發(fā)酵的影響，對其中效果最優(yōu)的氧載體的添加時間和添加量進行單因素比較和響應(yīng)面優(yōu)化［15］，以期為將其進一步應(yīng)用于擴大發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Streptomyces fungicidious KS 010：浙江凱勝科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

全溫振蕩培養(yǎng)箱：HZ－F160型，太倉市實驗設(shè)備廠；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ－LS－75Ⅱ型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

高效液相色譜儀：2478 DualλAbsorbance Detector，600 controller，717 plus Autosampler，Empower色譜工作站，美國Waters公司；

p H計：DELTA 320型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SHP－250型，上海森信實驗儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑

斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20.0 g／L，KNO31.0 g／L，K2HPO40.5 g／L，MgSO4·7H2O 0.5 g／L，NaCl 0.5 g／L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g／L，瓊脂20.0 g／L，p H 7.2～7.4；

種子培養(yǎng)基：玉米漿3.5%，可溶性淀粉3.5%，玉米蛋白粉0.5%，CaCO32.0%，適量泡敵，消后p H 7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.03%，玉米淀粉3.5%，玉米漿2.0%，玉米蛋白粉 3.0%，NH4Cl 0.50%，NaCl 1.50%，酵母膏1.2%，K2HPO43H2O 0.15%，ZnCl20.12%，α－淀粉酶0.1%80～90℃糊化20～30 min，加 CaCO31.5%，適量泡敵，消后p H 7.0～7.5；

恩拉霉素預(yù)混劑（對照品）：含量10%，浙江海正藥業(yè)股份有限公司；

Tween－80、乙酸乙酯、油酸、正十六烷、甲醇、丙酮：分析純，浙江匯普化工儀器有限公司；

玉米蛋白粉、玉米漿、玉米淀粉、α－淀粉酶、豆油（食用級）：浙江凱勝科技有限公司；

乙腈：色譜純，Honeywell Burdick ＆Jackson，USA。

1.2 培養(yǎng)方法

（1）種子擴培：取斜面活化菌種，接種于100 m L種子培養(yǎng)基中。28℃，200 r／min，搖瓶培養(yǎng)48 h。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)：取種子擴培液，按15%（V／V）的接種量接 種 于 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基 中。33 ℃［7］，200 r／min，搖 瓶 培養(yǎng)10 d［7］。

1.3 測定方法

1.3.1 HPLC法測定恩拉霉素含量 準(zhǔn)確量取一定體積發(fā)酵液，使用細胞破碎儀破碎10 min，將破碎后發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至100 m L容量瓶中，用浸提液定容至刻度，搖勻后28℃靜置30 min。取出后4 000 r／min離心15 min，得上清液備用。

采用Waters液相色譜儀分析，色譜柱為C18色譜柱（5μm，4.6 mm ×250 mm），流動相為30%乙腈和70%的0.05 mol／L的 KH2PO4水 溶 液 （p H 4.5），檢 測 波 長268 nm，流速1.0 m L／min［7］。

1.3.2 菌體濃度的測定 準(zhǔn)確量取一定體積培養(yǎng)一定時間的發(fā)酵液于50 m L離心管中，8 000 r／min下離心5 min，倒出上清液，準(zhǔn)確量取上清液體積。按式（1）計算菌體濃度：

1.4 氧載體優(yōu)化試驗

1.4.1 氧載體的選擇 選擇Tween－80、油酸、乙酸乙酯、正十六烷作為待測氧載體，在搖瓶發(fā)酵初始分別添加2%的量，以不添加氧載體為對照。在轉(zhuǎn)速200 r／min，33℃的條件下培養(yǎng)10 d。通過測定各搖瓶菌體濃度和恩拉霉素相對含量，篩選促進恩拉霉素合成的最適氧載體。

1.4.2 最適氧載體添加量試驗 在確定了氧載體的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵初始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5%，1.0%，2.0%，4.0%，8.0%的最適氧載體，以不添加氧載體為對照，在轉(zhuǎn)速200 r／min，33℃的條件下培養(yǎng)10 d。通過測定各搖瓶菌體濃度和恩拉霉素相對含量，確定最適氧載體的最佳添加量。

1.4.3 最適氧載體添加時間試驗 在最適氧載體添加量試驗的基礎(chǔ)上，考察不同時間添加最適氧載體對恩拉霉素發(fā)酵的影響。試驗中分別在0，2，4，6 d 4個時間點向發(fā)酵液中加入最佳濃度的氧載體，以不添加氧載體作為對照，在轉(zhuǎn)速200 r／min，33℃的條件下培養(yǎng)10 d。通過測定各搖瓶菌體濃度和恩拉霉素含量，確定最適氧載體的最佳添加時間。

1.4.4 二階響應(yīng)曲面優(yōu)化最適氧載體添加方式 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以最適氧載體的加入量和加入時間為中心，體系中恩拉霉素產(chǎn)量Y為目標(biāo)響應(yīng)值，采用二階響應(yīng)曲面優(yōu)化最適氧載體的添加量和添加時間，獲得最優(yōu)的添加方式。

1.4.5 驗證實驗 以二階響應(yīng)曲面優(yōu)化所得到的最優(yōu)添加方式重復(fù)驗證3次，根據(jù)所得恩拉霉素含量的平均值與理論值間的差異，評價二階響應(yīng)模型的正確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適氧載體的選擇

根據(jù)1.4.1項中方法進行試驗，比較不同氧載體對恩拉霉素發(fā)酵的影響，不同氧載體體系得到的菌體濃度和恩拉霉素的相對含量結(jié)果見表1。

表1 添加不同種類氧載體對恩拉霉素發(fā)酵的影響Table 1 Effects of different oxygen－vectors on fermentation production of enramycin

由表1可知，以菌體濃度為指標(biāo)，添加2%的乙酸乙酯、豆油和正十六烷試驗組的菌體濃度均高于對照組，其中添加正十六烷試驗組的菌體濃度可以達到53%，高于對照組13%。而添加Tween－80和油酸的試驗組的菌體濃度均低于對照組?？梢姴⒉皇撬械难踺d體都可以提高恩拉霉素生產(chǎn)菌的菌體濃度。以恩拉霉素相對含量為指標(biāo)，添加2%的豆油和正十六烷試驗組的恩拉霉素相對含量均高于對照組，分別提高了39.57%和62.74%，說明這兩種氧載體均可以提高恩拉霉素產(chǎn)量，并且對菌體生長無影響。而添加相同濃度的Tween－80、油酸試驗組的恩拉霉素相對含量均比對照組低，說明這兩種有機溶劑抑制菌體的生長，進而影響恩拉霉素的合成，可能是這些有機溶劑對菌體細胞的毒性或刺激性較大，生物相容性不好。此外，添加2%的乙酸乙酯，菌體濃度較對照增加了4%，但是恩拉霉素相對含量只有對照組的57.93%，可能是因為乙酸乙酯作為一種表面活性劑可以減小發(fā)酵液中氣泡的直徑，有利于發(fā)酵液中氧的傳遞，促進菌體濃度略微增加，但乙酸乙酯可能不利于恩拉霉合成，故其無法提高恩拉霉素的產(chǎn)量。根據(jù)表1結(jié)果，選擇正十六烷作為最適氧載體開展后續(xù)試驗。

2.2 正十六烷濃度對恩拉霉素發(fā)酵的影響

根據(jù)1.4.2項中方法，比較添加不同濃度正十六烷對恩拉霉素發(fā)酵的影響，不同濃度正十六烷體系下得到的菌體濃度和恩拉霉素的相對含量結(jié)果見圖1。

圖1 正十六烷添加量對恩拉霉素發(fā)酵的影響Figure 1 Effects of different concentration of n－h(huán)exadecane on fermentation production of enramycin

由圖1可知，與未加入正十六烷的對照相比較，正十六烷的添加量為0.5%時，體系的菌體濃度增加了13%，恩拉霉素的相對含量提高了96.85%。當(dāng)添加量超過1.0%時，菌體的生長開始受到抑制，但是對恩拉霉素合成的促進作用依然明顯。當(dāng)添加量達到4.0%時，菌體生長已經(jīng)受到很明顯的抑制，菌體濃度僅較對照提高了3%，恩拉霉素相對含量大幅下降，僅高出對照組31.45%。單因素試驗結(jié)果表明，恩拉霉素發(fā)酵過程中添加0.5%正十六烷作為氧載體，可以改善發(fā)酵液中的溶氧情況，較好地促進菌體的生長及恩拉霉素的合成。

2.3 正十六烷添加時間對恩拉霉素發(fā)酵的影響

參照1.4.3項中的方法，在0，2，4，6 d分別添加0.5%正十六烷，比較正十六烷不同添加時間對恩拉霉素發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 正十六烷添加時間對恩拉霉素發(fā)酵的影響Figure 2 Effects of adding time of n－h(huán)exadecane on fermentation production of enramycin

由圖2可知，在接種后48 h內(nèi)添加0.5%正十六烷，均能提高菌體濃度和恩拉霉素產(chǎn)量，并且在48 h添加的效果最為明顯，其菌體濃度及恩拉霉素含量分別較對照組提高了9%和76.39%，較0 h添加提高了2%和22.09%。而在接種48 h之后添加0.5%的正十六烷，菌體濃度和恩拉霉素相對含量逐漸下降，不及48 h添加正十六烷的效果好，說明恩拉霉素生產(chǎn)菌在生長對數(shù)期（48 h）對氧的需求更強烈，存在著溶解氧的不足，此時添加氧載體更有利于菌體的生長和后期恩拉霉素的積累。因此，恩拉霉素發(fā)酵過程中氧載體正十六烷較佳添加時間是在接種48 h（對數(shù)生長期）。

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

綜合以上單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面法優(yōu)化氧載體正十六烷添加方式。以恩拉霉素含量（Y）為評價指標(biāo)，對氧載體正十六烷的添加量（A）和添加時間（B）這兩個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化，響應(yīng)面試驗的因素水平見表2，響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平及編碼Table 2 Factors and levels in the central composite experimental design

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果Table 3 Design and results of the response surface methodology

采用Design－Expert軟件進行二元回歸擬合，得到恩拉霉素含量為響應(yīng)值的回歸方程：

回歸方程分析見表4，正十六烷的添加量與添加時間的響應(yīng)面與等高線圖見圖3。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance in regression

由表4可知，B、A2、B2對Y（恩拉霉素含量）的影響極其顯著。模型方程的F 值為143.15，Prob＞F 的值＜0.000 1，說明模型是極其顯著的，而失擬項的F值為2.34，Prob＞F的值為0.215，說明是不顯著的?；貧w方程相關(guān)系數(shù)R2＝0.980 3，高度顯著，說明響應(yīng)值（恩拉霉素含量）的變化有98.03%來源于所選變量，因此該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，使用該方程進行真實的試驗點分析是可靠的。由響應(yīng)面圖（圖3）可知，正十六烷的最優(yōu)添加時間為44.10 h，最優(yōu)添加量為0.72%，該條件下恩拉霉素理論最高含量為2 964.26 mg／L。

2.5 優(yōu)化參數(shù)驗證

在正十六烷最優(yōu)添加方式下進行驗證實驗，重復(fù)3次，結(jié)果表明，在此條件下得到恩拉霉素含量平均值為2 940.65 mg／L，與理論預(yù)測值的相對誤差在0.80%，因此采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的二次多項式回歸方程準(zhǔn)確、可靠。實際測得生產(chǎn)菌菌體濃度較對照提高了23%，恩拉霉素含量比對照組（1 733.51 mg／L）提高了70%。

圖3 正十六烷的響應(yīng)面和等高線圖Figure 3 Response surface and contour lines of nhexadecane

3 結(jié)論

恩拉霉素發(fā)酵生產(chǎn)屬于好氧型發(fā)酵，但是發(fā)酵過程中使用的培養(yǎng)基黏度大、固形物含量高，發(fā)酵過程中菌絲體容易結(jié)團，導(dǎo)致發(fā)酵系統(tǒng)的溶氧速率降低。傳統(tǒng)供氧方式通常是采用大通氣量及高速攪拌速率相結(jié)合，但是高機械強度會增強剪切力，造成菌絲體的損傷，使菌絲體受損不能正常代謝，生產(chǎn)能力下降，同時操作成本也會大幅度增加。因而供氧成為制約恩拉霉素發(fā)酵過程中生物反應(yīng)的重要因素，而氧載體發(fā)酵體系由于具有剪切力小、能耗低、氧傳遞速度快等特點，近年來成為新的研究方向，而氧載體應(yīng)用于恩拉霉素方面的文獻鮮有報導(dǎo)。

油酸、豆油、正十六烷是常用的氧載體，其鋪展系數(shù)為正值，氧在其中有更高的溶解度，其中氧在正十六烷中的溶解度比其在水中的高8倍［16］。郝冬霞［17］發(fā)現(xiàn)61.6 h添加體積分數(shù)為0.123的正十六烷可以提高慶大霉素的生產(chǎn)效價20%以上。王啟軍［18］在黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶過程中添加油酸作為氧載體能夠促進產(chǎn)酶。劉元帥等［19］將體積分數(shù)10%的正十六烷添加到紅法夫酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，使紅法夫酵母單位類胡蘿卜素合成能力提高了18%。

本研究首先對多種有機溶劑作為氧載體的效果進行比較，發(fā)現(xiàn)并不是所有的氧載體均適用于恩拉霉素的發(fā)酵。其中Toween－80和油酸兩種有機溶劑對菌體細胞的毒性或刺激性較大，生物相容性不好，會抑制菌體生長，進而影響恩拉霉素合成；而豆油和正十六烷作為氧載體均可以有效提高生產(chǎn)菌菌體濃度和恩拉霉素產(chǎn)量，但豆油添加量過大，且發(fā)酵結(jié)束后不易分離，生產(chǎn)成本大幅增加，所以選擇正十六烷作為恩拉霉素發(fā)酵中最適添加氧載體。接著對氧載體正十六烷的添加量和添加時間進行響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果顯示在44.10 h添加0.72%的正十六烷可以使生產(chǎn)菌菌體濃度較對照提高23%，使恩拉霉素產(chǎn)量提高70%。因此，添加正十六烷能加強發(fā)酵液中氧傳遞，提高溶氧水平，從而促進菌體生長及恩拉霉素合成。

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