劉曉青

沙河市人民醫(yī)院藥劑科，河北 沙河 054100

市售蘄蛇樣品的傳統(tǒng)鑒定與分子生物學(xué)鑒定特征

劉曉青

沙河市人民醫(yī)院藥劑科，河北 沙河 054100

目的：探討不同方法對(duì)市售蘄蛇樣品真?zhèn)翁卣麒b別結(jié)果的準(zhǔn)確性。方法：對(duì)來(lái)自不同銷售公司蘄蛇樣品分別采用傳統(tǒng)鑒別方法和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果：采集三個(gè)城市醫(yī)藥銷售公司共30個(gè)蘄蛇樣品，傳統(tǒng)外觀和顯微鏡方法鑒定30個(gè)樣品中有25個(gè)正品，5個(gè)偽品，合格率為83.3%；用分子生物學(xué)方法從市售蘄蛇樣品中抽提線粒體D N A，采用PCR方法進(jìn)行特異性引物擴(kuò)增。30個(gè)蘄蛇樣品中合格品20個(gè)，不合格品10個(gè)，合格率為66.67%。結(jié)論：傳統(tǒng)鑒別方法鑒別市售蘄蛇樣品特異性較低，分子生物學(xué)方法檢測(cè)簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快捷，對(duì)規(guī)范市售蘄蛇中藥材市場(chǎng)具有廣闊前景。

蘄蛇；鑒定；PCR技術(shù)

蘄蛇作為藥用資源，始載于宋代寇宗爽的《開(kāi)寶本草》，在我國(guó)已有2千多年的應(yīng)用歷史。生物學(xué)分類蘄蛇屬脊索動(dòng)物門爬行綱蝰科（Viperidae）動(dòng)物五步蛇Agkistrodon acudus（Guenther），藥材為除去其內(nèi)臟的干燥體。主要產(chǎn)自浙江省溫州、麗水、金華地區(qū)，江西、福建、廣西等地亦產(chǎn)。具有祛風(fēng)，通絡(luò)，止痙的功效。主要用于風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣、中風(fēng)、半身不遂、破傷風(fēng)、抽搐痙攣、皮膚疥癬等。由于蛇類資源遭到過(guò)度破壞，本品市場(chǎng)較為緊缺，價(jià)格昂貴，市售商品中普遍存在偽品、混淆品、摻假品。近年來(lái)蘄蛇偽品造假手段越發(fā)高明，僅根據(jù)形態(tài)學(xué)特征來(lái)鑒別已不能滿足市場(chǎng)需要［1-2］。本研究通過(guò)采用傳統(tǒng)鑒定方法與分子生物學(xué)方法對(duì)市售蘄蛇樣品進(jìn)行鑒別，以探討不同方法對(duì)市售蘄蛇樣品真?zhèn)舞b定的準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)（上海醫(yī)用儀器廠）；H-2050 R型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；S H A-B型水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠）；D Y Y-8 B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；9700型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)A B I）；UVWHITE2020D凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Biorad公司）。

1.2 藥材與試劑 正品蘄蛇（中國(guó)藥品生物制品研究所提供并鑒定）；30個(gè)市售蘄蛇樣品分別來(lái)自鄭州、開(kāi)封、洛陽(yáng)三地醫(yī)藥經(jīng)銷公司，每個(gè)公司隨機(jī)抽樣10個(gè)蘄蛇樣品；裂解液［10mmol/LTris-Cl（p H7.6）、10mmol/LNa2EDTA，50mmol/LNaCl］；蛋白酶K（20mg/m L）；SDS（1 0%）；飽和醋酸鈉、異丙醇、乙醇、TaqDNA聚合酶、游離脫氧核苷三磷酸dNTPs；瓊脂糖凝膠（西班牙Agarose公司）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)鑒別方法

2.1.1 外觀 正品蘄蛇判斷參見(jiàn)文獻(xiàn)［3］方法。呈圓盤狀，盤徑1 7～3 4c m，全體具鱗片。頭在中央稍向上，呈扁三角形，吻端向上突出，習(xí)稱“翹鼻頭”，眼后至頸側(cè)有一條黑色斑紋，口寬大，上顎有1對(duì)毒牙；背部紅棕色，有2 4個(gè)灰白色菱方形斑紋，習(xí)稱“方勝紋”；腹部灰白色，鱗片較大，有多數(shù)類圓形黑斑，習(xí)稱“連珠斑”；尾部驟細(xì)，末端有三角形深灰色的角質(zhì)鱗片1枚，習(xí)稱“佛指甲”；氣腥，味甘咸。

2.1.2 顯微鏡鑒別［4］

2.1.2.1 碎片 粉末黃白色或淡黃色。角質(zhì)鱗片特征：近無(wú)色或淡黃色角質(zhì)鱗片，表面觀呈類圓型、卵圓形或類多角形隆起，覆瓦狀排列，側(cè)面觀呈半圓形或乳頭狀突起，散在淡灰色或淡棕色細(xì)顆粒狀物分布；表皮細(xì)胞特征：界限不清楚，密布暗棕色色素顆粒，多聚集成不規(guī)則網(wǎng)狀或分枝狀；橫紋肌特征：纖維較多無(wú)色或淡黃色，多碎斷；側(cè)面觀呈薄片，邊緣較平直，橫紋細(xì)密平直或微波狀，明暗相間有的不清晰；橫斷面呈圓形或類橢圓形，有小孔或裂隙；骨碎片呈不規(guī)則，骨陷窩類圓形或梭形，多呈同方相排列，骨小管較細(xì)，有細(xì)密的斜向排列紋理。

2.1.2.2 背鱗 鱗片呈深棕色或黃棕色，密布乳頭狀突起，乳突呈類三角形。類卵圓形或不規(guī)則形，內(nèi)含顆粒狀色素；橫切面部分真皮和表皮向外乳頭狀突起，外表面呈波浪狀形，突起部真皮含較多色素；內(nèi)表面較平直，沒(méi)有乳頭狀突起。

2.2 分子生物學(xué)方法

2.2.1 模板DNA提取 取蘄蛇樣品剪碎至1m m3左右，稱取樣品0.0 5g加入5 0 0μL裂解液，3 0μL1 0%S D S，1 5μL蛋白酶K，混勻后置于5 6℃水浴振蕩1 6～1 8小時(shí)。取出加入5 0 0 μL飽和醋酸鈉，輕輕振蕩1 0分鐘，4℃1 1 0 0 0 r/m i n離心1 0 m i n，取上清液加入等體積異丙醇，-2 0℃放置1小時(shí)；取出4℃1 1 0 0 0 r/m i n離心1 0 m i n，棄上清液，向沉淀中加入2 0 0 μL 7 0%乙醇充分沖洗，4℃1 1 0 0 0 r/m i n離心1 0 m i n，留沉淀室溫干燥；加入8 0μL滅菌雙蒸水溶解D N A，作為供試品模板進(jìn)行P C R反應(yīng)。

2.2.2 PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系為3 0μL，包括1 0×P C R緩沖液2.5μL，d N T P（2.5m m o l/L）2μL，引物（1 2.5 μm o l/L）各0.5 μL，模板（包括陽(yáng)性對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照品）0.5 μL，T a qD N A聚合酶（1 U/μL）1 μL，加雙蒸水補(bǔ)至3 0 μL，加入2 0 0 μL反應(yīng)管中；將反應(yīng)管置P C R儀，P C R反應(yīng)參數(shù)為9 5℃預(yù)變性5 m i n，循環(huán)反應(yīng)3 0次（9 5℃3 0 s，6 3℃4 5 s，7 2℃3 0 s，7 2℃延伸5 m i n）。P C R結(jié)束后在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.3PCR反應(yīng)鑒定 取P C R擴(kuò)增后的反應(yīng)管中液體1 0～1 5 μL與上樣緩沖液3～5 μL充分混勻，點(diǎn)在含E B染色劑的1%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，電泳2 0～3 0 m i n（1 0 V/c m），至藍(lán)色指示劑距點(diǎn)樣孔2～4 c m時(shí)結(jié)束電泳，將凝膠置于紫外分析儀上觀察，拍照。

2.3 結(jié)果

2.3.1 傳統(tǒng)方法檢測(cè) 傳統(tǒng)鑒別方法鑒定3 0個(gè)樣品，有2 5個(gè)正品，5個(gè)偽品，合格率為8 3.3%。

2.3.2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜 若在與陽(yáng)性對(duì)照（2 0 0～3 0 0 b p）同一位置處出現(xiàn)條帶且陰性對(duì)照無(wú)條帶，則樣品為正品蘄蛇（圖1—3）。3 0個(gè)蘄蛇樣品中合格品2 0個(gè)，不合格品1 0個(gè)，合格率為6 6.6 7%。

圖1開(kāi)封地區(qū)市售蘄蛇樣品PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖2 洛陽(yáng)地區(qū)市售蘄蛇PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖3 鄭州地區(qū)市售蘄蛇PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖譜

3 討論

蘄蛇作為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，需求量較大。為了獲取暴利，商販對(duì)蘄蛇藥材的造假辦法層出不窮，傳統(tǒng)的鑒別方法已經(jīng)不能滿足市場(chǎng)需要。因此，了解市場(chǎng)蘄蛇藥材質(zhì)量情況具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)本院來(lái)自3個(gè)城市的30個(gè)蘄蛇樣品進(jìn)行質(zhì)量分析，傳統(tǒng)方法結(jié)果表明合格率為83.3%，采用分子生物學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)合格率為66.6%。說(shuō)明本地區(qū)蘄蛇樣品質(zhì)量需要進(jìn)一步規(guī)范。

蘄蛇常見(jiàn)摻假品主要有死后變質(zhì)的蘄蛇加工干燥品；鮮蘄蛇剖腹后在蛇身皮下?lián)饺氘愇镌诒P圓定型；利用餐廳食用蘄蛇去掉的頭皮尾，貼在去頭皮尾的雜蛇身上，定型干燥而成［5］。

常見(jiàn)的偽品及混淆品包括百花錦蛇、眼鏡蛇、銀環(huán)蛇、金環(huán)蛇、滑鼠蛇、烙鐵頭、山烙鐵頭等［6-8］。百花錦蛇為游蛇科動(dòng)物百花錦蛇的干燥體。呈圓盤狀，頭盤于中央，呈方圓形，先端較窄，無(wú)頰窩；頭背有對(duì)稱大鱗，體背部灰黑色；脊部有深褐色的大斑紋交錯(cuò)排列；背鱗平滑或微具棱，體中部有鱗片2 7行，尾較長(zhǎng)，尾端無(wú)角質(zhì)鱗片；氣腥，味微咸。眼鏡蛇為眼鏡蛇科動(dòng)物眼鏡蛇的干燥體。呈圓盤狀，頭盤于中央，呈橢圓形而扁平，頸部有淺色不規(guī)則的“眼鏡狀”斑紋；上唇鱗7枚，口內(nèi)具溝狀牙；頭背有對(duì)稱大鱗片，背部黑褐色，有單或成雙排列的波狀橫斑紋，背鱗中段2 1行，平滑；腹部灰白色，尾細(xì)。金環(huán)蛇為眼鏡蛇科動(dòng)物金環(huán)蛇的干燥體；呈圓盤狀，頭盤于中央，呈橢圓形而略圓；上唇鱗7枚，口內(nèi)具溝狀牙；頭背有對(duì)稱大鱗片；頭背和背部棕褐色，有金黃色寬4～5鱗片的橫斑紋，背鱗中段15行，平滑，尾下鱗單行，尾細(xì)。銀環(huán)蛇為眼鏡蛇科動(dòng)物銀環(huán)蛇的干燥體。呈圓盤狀，頭稍大于頸且頭在中央，尾細(xì)常納于口內(nèi)；鼻鱗2片，鼻孔橢圓形；體鱗光滑，全身概為15列，背部中央的1行鱗片特別大，呈六角形；腹鱗200～218行，肛鱗l片，尾下鱗單行，40～51片；尾細(xì)長(zhǎng)而尖，體黑色，腹部白色，略有灰黑色小斑點(diǎn)；氣微腥，味微咸?；笊邽橛紊呖苿?dòng)物滑鼠蛇的干燥體。呈圓盤狀，頭盤于中央，呈橢圓形，無(wú)頰窩；口內(nèi)上頜全為同型邪齒，上唇鱗8枚；頭背黑褐色，有對(duì)稱大鱗，體背部橫棕色，有無(wú)規(guī)則的黑色橫斑；背鱗平滑，體中部有鱗片1 7行；尾較長(zhǎng)，尾端無(wú)角質(zhì)鱗片。

中藥材的傳統(tǒng)鑒別方法是利用每種藥材的特別之處，或觀其形，或辨其色，或嘗其味，或感其質(zhì)，或兼而有之，言簡(jiǎn)意賅，傳神易記。這種傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別方法簡(jiǎn)便易行，不需要特殊的設(shè)備條件，在臨床廣泛應(yīng)用，尤其適宜于不具備現(xiàn)代中藥鑒別設(shè)備的基層醫(yī)療單位推廣應(yīng)用，能有效防止以假充真，以劣充優(yōu)的情況發(fā)生，從而保證臨床用藥的安全［8］。但是，一方面由于性狀特征是原植物（原動(dòng)物）形態(tài)特征的廣義延伸，多少保留了部分原植物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)等信息，因此性狀特征一致的藥材出現(xiàn)假藥的概率相對(duì)小一些。其中有一部分中藥材和中藥飲片的性狀特征突出，它們保留了原植物（原動(dòng)物）明確的物種信息，單純憑一片飲片或藥材的性狀特征就能鑒定到物種。另一方面，由于中藥材及其飲片大部分只是藥用植物或動(dòng)物的一部分，而且經(jīng)過(guò)凈制、切制、干燥、加工和炮制等，在此過(guò)程中失去很多代表來(lái)源物種的信息，增加了其物種鑒定的難度，因此大部分中藥單憑性狀很難準(zhǔn)確確定品種，還需要輔助其他方法，以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

大量實(shí)驗(yàn)證明分子生物學(xué)方法在藥材質(zhì)量控制領(lǐng)域有廣闊的發(fā)展前景，已廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定［9］，其中，蘄蛇的分子生物學(xué)鑒定已列入中國(guó)藥典（2010）［10］。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快捷，能夠滿足當(dāng)今蘄蛇藥材市場(chǎng)檢測(cè)的要求。

［1］冷愛(ài)晶.蘄蛇及其偽品的鑒別［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2003，14（3）：154.

［2］玉凝，李軍，高翔，等.中藥鑒定學(xué)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003：211.

［3］陳志清.蘄蛇的真?zhèn)舞b別和鑒別要點(diǎn)［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2012，16（2）：50-51.

［4］柳偉.蘄蛇及其摻偽品的鑒別［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（5）：787-788.

［5］Chen Y C，W u X F，Zhao E.Cl assi fi cat i on of agki st rodon speci es i n Chi na［J］.Toxi con，1984，22（1）：53-61.

［6］陳曉紅.基層醫(yī)院采購(gòu)蘄蛇如何鑒別其真?zhèn)危跩］.陜西中醫(yī)，2009，30（10）：1397-1398.

［7］唐曉晶，馮成強(qiáng)，黃璐琦，等.蘄蛇及其混淆品高特異性PCR鑒別［J］.藥物分析雜志，2006，26（2）：152-155.

［8］Wang Yiquan，Zhou Kaiya，XU Luoshan，etal.Sequenci ng of Cytb gene fragm ent s and PCR i dent i fi cat i on of "j i nqi an bai huashe"（Bungrus parvus）and i t s adult erant s［J］.Y ao X ue X ue Bao，1988，33（12）：941-947.

［9］宋文成，宋社吾，劉道芳，等.蘄蛇藥材及其市售混淆品的Cyt b基因序列與分析［J］.中草藥，2006，12：1862-1865.

［10］中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典：一部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：361.

Characteristics of Commercial Ancistrodon Acutus Identified by Traditional Method and Molecular Biology

LIU Xiaoqing
Department of Pharmacy of Shahe Municipal People′s Hospital，Shahe 054100，China

Objective：To investigate the accuracy of different methods in distinguishing commercial ancistrodon acutus.Methods：The samples from different companies were identified with traditional method and the method of molecular biology respectively.Results：Altogether 30 kinds of samples from three pharmaceutical companies were collected.the results showed that there were 25 kinds of authentic ones and five counterfeit ones，qualification rate was 83.3%；DNA of mitochondria were extracted from the samples by the method of molecular biology，specific primers were amplified by PCR method.There were 20 kinds of qualified goods and ten kinds of unqualified ones，qualification rate was 66.67%.Conclusion：Traditional identification method is of low specificity，the method of molecular biology is simple，accurate and rapid，it demonstrates broad prospect to regulate the marketing of ancistrodon acutus.

ancistrodon acutus；identification；PCR technique

R282.5

A

1004-6852（2014）05-0016-03

2013-07-20

劉曉青（1971—），女，副主任藥師。研究方向：藥品鑒定。