劉俊偉 張慧玲 李 斌 劉旭玲 王均爐 汪煒建△

（1.山西省陽(yáng)煤集團(tuán)總醫(yī)院，山西 陽(yáng)泉 045000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

人參皂苷Rb1聯(lián)合亞低溫對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究*

劉俊偉1張慧玲1李 斌1劉旭玲2王均爐2汪煒建2△

（1.山西省陽(yáng)煤集團(tuán)總醫(yī)院，山西 陽(yáng)泉 045000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

目的 觀察人參皂苷Rb1聯(lián)合亞低溫對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，探討其可能的作用機(jī)制。方法 SD大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（M組）、人參皂苷Rb1治療組（G組）（40mg/kg）、亞低溫治療組（H組），控制肛溫在（33±1）℃，缺血后持續(xù)2h，亞低溫聯(lián)合人參皂苷Rb1治療組（HG組）。除Sham組外，其余各組均采用Zea Longa法制作局灶性腦缺血再灌注損傷模型（MCAO模型），各組于再灌注后24h對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分；評(píng)分后麻醉取血，測(cè)血清中S100β的變化。斷頭取腦組織，采用TTC法進(jìn)行腦梗死體積測(cè)定。結(jié)果 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分除Sham組之外，其余各組大鼠于再灌注24h后均出現(xiàn)神經(jīng)缺失癥狀。單獨(dú)使用H或G能夠顯著改善24h時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能，梗死率和降低S100β表達(dá)（P＜0.05），聯(lián)合應(yīng)用療效均明顯增強(qiáng)（P＜0.01），且聯(lián)合用藥與單獨(dú)應(yīng)用任一藥物相比在各項(xiàng)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 大鼠腦缺血后即刻實(shí)施亞低溫（33±1）℃或40mg/kg腹腔注射人參皂苷Rb1均有不同程度的腦保護(hù)作用，兩者聯(lián)合應(yīng)用具有增強(qiáng)作用。

亞低溫 人參皂苷Rb1 腦缺血 再灌注損傷 S100β

大量研究表明亞低溫可以通過(guò)多種機(jī)制對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，亞低溫過(guò)程中容易發(fā)生低血壓、電解質(zhì)紊亂、心律失常，干擾凝血系統(tǒng)增加血液凝固的危險(xiǎn)及呼吸系統(tǒng)感染增加等并發(fā)癥?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外的學(xué)者在腦缺血再灌注損傷的治療方面都比較贊同多種干預(yù)聯(lián)合治療，希望達(dá)到更好的治療效果。適當(dāng)?shù)闹嗅t(yī)藥聯(lián)合亞低溫治療能更好地起到腦神經(jīng)保護(hù)作用。人參皂苷Rb1是人參中的主要活性成分之一，是人參二醇型最具代表的活性成分。本實(shí)驗(yàn)擬在建立穩(wěn)定、可靠的局灶性腦缺血再灌注損傷模型基礎(chǔ)上，研究人參皂苷Rb1聯(lián)合亞低溫對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量260～300g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

1.2 材料與試劑 人參皂苷Rb1購(gòu)于上海同田生物技術(shù)公司。血清S100β定量雙抗體夾心ELISA試劑盒（上海西唐生物有限公司）。綠化三苯基四氮唑TTC試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。TM902電子測(cè)溫計(jì)購(gòu)于北京云飛五金機(jī)電有限公司

1.3 分組與造模 雄性SD大鼠40只隨機(jī)分為5組，假手術(shù)組（Sham組，n=8），模型組（M組，n=8），人參皂苷Rb1治療組（G組，n=8），亞低溫治療組（H組，n=8）、人參皂苷Rb1聯(lián)合亞低溫治療組（HG組，n=8）。隨機(jī)抽取8只SD大鼠為Sham組，Sham組只做手術(shù)操作，不插入線栓。除Sham組外其余4組均參照Z(yǔ)ea Longa的方法建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型，大鼠均選擇右側(cè)為栓塞側(cè)。術(shù)前12h禁食，自由飲水。參照改良Zea Longa等［1］的方法，采用頸外動(dòng)脈插入線栓法制作模型。所有大鼠稱重后，用10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，頸部備皮，75％酒精消毒后，頸部正中切口長(zhǎng)約3～4cm，依次鈍性分離肌肉，組織，暴露右側(cè)迷走神經(jīng)，頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），分離迷走神經(jīng)是注意避免損傷，以免引起呼吸驟停。將提前準(zhǔn)備好的絲線分別在CCA近心端，ECA遠(yuǎn)端掛線（ECA掛線3條，在CCA距分叉處5mm處結(jié)扎遠(yuǎn)心端兩條絲線）。動(dòng)脈夾夾住CCA近心端與ICA遠(yuǎn)心端。沿著ECA動(dòng)脈結(jié)扎兩線間將其剪斷，在ECA距CCA分叉處之間，距離短端2mm左右剪一小口。將提前準(zhǔn)備好線栓沿小切口插入約5mm后，將預(yù)先放置在ECA根部的絲線打結(jié)將其固定，然后松開(kāi)ICA遠(yuǎn)心端的動(dòng)脈夾，將線栓緩慢地向ICA入顱方向推進(jìn)大約18～19mm后再將固定絲線收緊再次打結(jié)，防止大鼠出血。在向顱內(nèi)送線栓時(shí)如果遇到阻力時(shí)，應(yīng)停止并調(diào)整進(jìn)線栓方向，一般都可以成功地完成，縫合皮膚。此時(shí)即完成右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型，記錄此刻時(shí)間，約2h后拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。在手術(shù)全過(guò)程中使用電子體溫計(jì)探頭插入大鼠肛門監(jiān)測(cè)大鼠體溫。Sham組、M組、G組體溫維持在36～37℃；H組和HG組體溫維持在32～34℃。

1.4 給藥方法 Sham組：不插入線栓，只做栓塞模型的手術(shù)操作。M組：線栓插入后腹腔注射0.9％氯化鈉注射液4mL/kg。G組：插入線栓后立即腹腔注射40mg/kg。H組：插入線栓后腹腔注射相同劑量的0.9％氯化鈉注射液，將電子體溫計(jì)探頭插入大鼠肛門（插入深度大于3cm）檢測(cè)大鼠體溫，同時(shí)利用酒精噴灑大鼠腹部物理降溫，10min內(nèi)誘導(dǎo)到目標(biāo)溫度，并利用冰塊，熾熱燈泡，電熱毯控制大鼠體溫在（33±1）℃。維持3h后室溫條件下復(fù)溫。HG組：插入線栓后如G組腹腔注射等量的人參皂苷（40mg/kg），同時(shí)誘導(dǎo)亞低溫并維持體溫在（33±1）℃。

1.5 指標(biāo)檢測(cè) 大鼠神經(jīng)功能障礙評(píng)分：各組大鼠于腦缺血再灌注損傷（MCAO）后24h時(shí)間點(diǎn)，參照的Zea Longa等的神經(jīng)功能缺失5分法標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)定。0分：正常，無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀。1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪。2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈。3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走困難，并有向左側(cè)傾倒征象。4分：無(wú)自發(fā)活動(dòng)行動(dòng)，意識(shí)水平下降。5分：死亡。

1.6 腦組織TTC染色 參照Lin等的方法進(jìn)行TTC染色。大鼠于MCAO后24h，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后將腦組織取出置于-20℃冰箱內(nèi)15min，沿冠狀面間隔2mm連續(xù)行5個(gè)切片，切片立即置于2％TTC磷酸緩沖液中，避光37℃恒溫孵育30min，15min中時(shí)翻轉(zhuǎn)1次，以達(dá)到染色均勻。梗死灶被染為白色，正常組織為紅色。將所有腦切片同側(cè)順序排列，用數(shù)碼相機(jī)Canon A480拍照后應(yīng)用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0（IIP6.0）進(jìn)行圖像分析處理。按照以下公式計(jì)算腦梗死體積：腦梗死率=梗死區(qū)域體積/對(duì)側(cè)大腦的體積×100％。血清S100β的檢測(cè)：腦缺血再灌注后24h 10％水合氯醛麻醉大鼠后，心臟取血，離心（4000轉(zhuǎn)/min離心10min）取血清。嚴(yán)格按照大鼠S100β定量雙抗體夾心ELISA試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)血清中S100β的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者兩兩比較用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnett′s檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能障礙評(píng)分比較 見(jiàn)表1。參照文獻(xiàn)［1］大鼠腦神經(jīng)功能缺失5分法標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各組大鼠于再灌注后24h給予神經(jīng)功能評(píng)分。與M組比，H組和G組及HG組神經(jīng)功能評(píng)分降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。HG組與H組及G組相比，改善更明顯（P＜0.05）。

表1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（分，±s）

表1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（分，±s）

與HG組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與M組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n Sham組 8 M組 8 H組 8評(píng)分0.00±0.00 3.07±0.92 2.00±0.68*△G組 8 1.93±0.62*△HG組 8 1.07±0.73△△

2.2 各組腦梗死體積結(jié)果比較 見(jiàn)表2。由于Sham組梗死體積為0，除Sham組外各組均出現(xiàn)不同程度的梗死區(qū)域。通過(guò)IPP6.0圖像軟件采集后計(jì)算出腦梗死率。與M組比，G組或H組梗死率明顯減少（P＜0.05），HG組梗死率減少最明顯（P＜0.01）；與H或G組比，HG組腦梗死率在大鼠腦缺血再灌注后24h梗死率明顯減少（P＜0.01）。

表2 大鼠腦梗死率和血清S100β含量（±s）

表2 大鼠腦梗死率和血清S100β含量（±s）

組 別 n Sham組 8 M組 8 H組 8 G組 8 HG組 8腦梗死率（％） 血清S100β含量（pg/mL）0.00±0.00 15.36±7.38 60.69±5.60 147.92±20.36 45.02±6.05**△ 85.27±6.32**△44.75±6.52**△ 93.78±8.39**△25.45±6.46△△ 52.35±10.37△△

2.3 各組血清S100β含量比較 見(jiàn)表2。與模型組比，G組或H組血清中S100β含量明顯減少（P＜0.05），HG組血清中S100β含量減少最明顯（P＜0.01）；與G或H組比，HG組血清中S100β含量在大鼠腦缺血再灌注后24h明顯減少（P＜0.01）。

3 討論

腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中包含興奮性氨基酸毒性增加，自由基的大量釋放引起的組織脂質(zhì)過(guò)氧化，鈣離子超載以及炎癥因子、凋亡等多種因素相互構(gòu)成的一個(gè)負(fù)反饋級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。多年來(lái)國(guó)內(nèi)外科學(xué)家試圖找到有效的藥物或干預(yù)來(lái)減輕腦缺血再灌注損傷，但是到目前為止能有效地應(yīng)用于臨床的仍然很少。目前單一的藥物臨床治療效果并不是很樂(lè)觀［2-4］，國(guó)內(nèi)外多提倡多種技術(shù)或藥物聯(lián)合應(yīng)用，綜合治療實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)。20世紀(jì)80年代中后期以來(lái)，各種動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)了亞低溫對(duì)缺血再灌注損傷后腦組織具有明顯的保護(hù)作用。亞低溫對(duì)腦的保護(hù)作用是臨床上行之有效的重要方法之一［5］。本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)腦缺血期實(shí)施亞低溫（32±1）℃可以有效減少腦梗死體積，改善神經(jīng)行為學(xué)。但亞低溫治療有諸如干擾凝血機(jī)制，發(fā)生心律失常等不良反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道［6］人參皂苷Rb1在心臟等其他器官的缺血再灌注損傷中也有較強(qiáng)的保護(hù)作用。可以減少大鼠暫時(shí)性腦缺血梗死面積和改善神經(jīng)功能缺失癥狀，具有明顯的抗腦缺血損傷作用，其作用機(jī)制有清除自由基，抗谷氨酸的神經(jīng)毒性作用有關(guān)，同時(shí)有抗心律失常改善凝血等作用。人參皂苷Rb1有抵抗亞低溫的副作用的效果。本實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)G組與M組相比腦梗死體積明顯減少，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯減少，這與李方成等研究結(jié)果一致。中成藥人參皂苷Rb140mg/kg與亞低溫（33±1）℃聯(lián)合作用的意義在于減少其并發(fā)癥、提高療效、對(duì)大鼠腦缺血缺氧發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制各有側(cè)重又互為補(bǔ)充。S100β蛋白是神經(jīng)組織蛋白的一種，是More于1965年首次發(fā)現(xiàn)，S100β蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的分布十分廣泛，高濃度存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或Shcwnan細(xì)胞中，被認(rèn)為是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白［7］。本實(shí)驗(yàn)中亞低溫組或人參皂苷Rb140mg/kg組均能減低血清中S 100β蛋白含量，兩者聯(lián)合作用更明顯，表明聯(lián)合治療有增強(qiáng)效果。但人參皂苷Rb1聯(lián)合亞低溫治療腦缺血的保護(hù)作用相關(guān)機(jī)制，還有待于進(jìn)一步更深入實(shí)驗(yàn)研究。

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Experimental Study of Ginsenoside Rb1 Combined with Mild Hypothermia on Cerebral Ischemia-Reper-fusion Injury

LIU Junwei，ZHANG Huiling，LI Bin，et al.
Yangquan Coal Group General Hospital，Yangquan 045000，China

Objective：To observe the protective effect of ginsenoside Rb1 combined with mild hypothermia on cerebral ischemia reperfusion injury，and to explore the possible mechanism.Methods：40 SD rats（250～300 g）were randomly divided into sham group（n=8），model group（M group，n=8），ginsenoside Rb1 treatment group（G group，n=8），mild hypothermia group（H group，n=8），and mild hypothermia combined with ginsenoside Rb1 treatment group（HG group，n=8）.All except sham group were made into MCAO models，followed by middle cerebral artery reperfusion 2 hours later according to Zea Longa method.24 h after reperfusion，the neurological deficit scores were recorded，the change of S100β in serum were detected，and the infarct volumes of rats in each group were assessed by TTC method.Results：Except for the sham group，the neurological function scores of rats in the remaining four groups were all deficient 24h after reperfusion.Compared with M group，neurological function of rats in G or H group significantly improved 24 h after reperfusion（P＜0.05）.The infarction rates of G and H group significantly reduced compared with M group（P＜0.05），and that of HG group significantly improved（P＜0.01）.Compared with the model group，decline of S100β levels in serum of G or H group was significant（P＜0.05），while that of HG group was the most obvious（P＜0.01）.Compared with G or H group，the serum S100β content in HG group significantly reduced 24h after reperfusion（P＜0.01）.Conclusion：Mild hypothermia（30±1）℃ and intraperitoneal injection of 40mg/kg ginsenosides Rb1 immediately after cerebral ischemia in rats have different degree of cerebral protection，and the joint application of these two measures can enhance the protective effect.

Mild hypothermia；Ginsenoside Rb1；Cerebral ischemia；Reperfusion injury；S100β

R285.5

A

1004-745X（2014）10-1793-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.008

2014-05-28）

浙江省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目（2011ZB086）；浙江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目（2010KYA134）；溫州市科技局科研項(xiàng)目（Y20080224）

△通信作者