分光光度法測定柿蒂中總?cè)扑岬暮?/h1>
2014-05-02 02:30:20馮海燕楊曉輝
石家莊學院學報 2014年6期
任 蕾，馮海燕，楊曉輝，雷 霓
（石家莊學院 化工學院，河北 石家莊 050035）
分光光度法測定柿蒂中總?cè)扑岬暮?/p>
任 蕾，馮海燕，楊曉輝，雷 霓
（石家莊學院 化工學院，河北 石家莊 050035）
測定中藥柿蒂中總?cè)扑岬暮?，以藥材中指標性成分熊果酸為對照品，采?%香草醛-冰醋酸、高氯酸顯色后，分光光度法測定柿蒂提取液中總?cè)扑岬暮?結(jié)果顯示：三萜酸含量在2.32-16.24 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為：A=0.056 7C+0.000 286，r=0.998 5.柿蒂中總?cè)扑岷繛?.93%，加樣回收率平均為103.09%.該法操作簡便，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠，可用于柿蒂藥材中三萜酸成分的質(zhì)量控制.
柿蒂；三萜酸；含量測定；分光光度法
柿蒂（Kaki calyx）是柿樹科植物柿的干燥宿萼，主產(chǎn)于河北、河南、山東、福建等地，是一種傳統(tǒng)中藥.其味苦、性溫，有降氣、止呃之功能，常用于胃寒氣滯的呃逆[1].除此以外，柿蒂提取物還有鎮(zhèn)靜、抗心率失常和一定的抗生育作用[2].研究表明三萜酸類化合物為柿蒂主要活性成分，但其測定方法未見國內(nèi)外報道.筆者采用分光光度法對柿蒂中總?cè)扑岬暮窟M行了測定，旨在為柿蒂的應用研究提供理論依據(jù)，也可用于柿蒂及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制.
1 儀器與試劑
1.1 儀器
UV/VIS-916紫外分光光度計（澳大利亞GBC科學器材有限公司）；YJ501型超級恒溫器（上海躍進醫(yī)療器械廠）；KQ-250DE醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（河南省鞏義市予華儀器有限責任公司）；FA2204B電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）.
1.2 試劑與材料
熊果酸（批號：110742-200518，中國藥品生物制品檢定所）；纖維素酶（批號：F20101015，國藥集團化學試劑公司）；無水乙醇、冰醋酸、高氯酸、香草醛、甲醇、乙酸乙酯等均為分析純，實驗用水為石英高純水.柿蒂購于安國東方藥城中藥材有限公司.
2 方法與結(jié)果
2.1 溶液的制備
對照品溶液：準確稱取熊果酸5.8 mg，置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解定容至刻度，得0.232 mg/mL對照品溶液.
供試品溶液：取柿蒂粉末，參照文獻[3]的條件用石油醚（60-90℃）脫色，再按以下3種方法分別對柿蒂總?cè)扑徇M行提?。?/p>
熱回流法 精確稱取2 g柿蒂，加入60%乙醇溶液50 mL，于80℃恒溫水浴鍋中回流提取2.5 h.減壓過濾，濾液定容至100 mL，得樣品Ⅰ.
超聲波法 精確稱取2 g柿蒂，加入70%乙醇溶液60 mL，在60℃的溫度下超聲萃取40 min.其它操作同熱回流法，得樣品Ⅱ.
酶輔助提取法 精確稱取2 g柿蒂，加入pH5.0 HAc-NaAc緩沖溶液18 mL和6 mg纖維素酶，置于45℃恒溫水浴鍋中酶解2h.酶解結(jié)束后沸水浴滅活3min，加入42mL無水乙醇，在60℃的條件下超聲提取40min.其它操作同熱回流法，得樣品Ⅲ.
2.2 測定波長的選擇
分別移取對照品溶液0.2 mL，Ⅰ-Ⅲ供試品溶液0.1 mL于10 mL量瓶中，沸水浴揮干溶劑，各加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸1.0 mL，混勻，密塞，其余同標準曲線項下操作，在200-700 nm進行波長掃描.結(jié)果表明，對照品和供試品溶液吸收變化趨勢基本相符，且在 550 nm處均有明顯吸收，故選擇測定波長為550 nm.
2.3 顯色條件的選擇
香草醛-冰醋酸、高氯酸比色法[3-6]是測定三萜酸類化合物常用方法，但其影響因素較多，試劑的用量、反應的溫度以及反應時間等因素影響較為顯著.實驗中考察了5%香草醛-冰醋酸用量 （0.1-0.5 mL）、高氯酸用量（0.6-1.4 mL）、水浴溫度（40-80℃）及顯色時間（5-25 min）對實驗的影響，確定了最佳的顯色條件為：加入5%香草醛-冰醋酸0.2 mL，高氯酸1.2 mL，混勻，密塞，置60℃水浴中恒溫加熱15min.在此前提下，針對文獻報道中定容溶劑不統(tǒng)一的現(xiàn)象[3-6]，還考察了定容溶劑對顯色體系的影響，結(jié)果如圖1所示.5種研究溶劑中，甲醇定容時體系的吸光度最小，僅為0.03；冰醋酸與乙酸乙酯定容時，吸光度最高.考慮到冰醋酸價格比較便宜，試驗選擇冰醋酸作定容溶劑.
2.4 線性關(guān)系考察
圖1 定容溶劑對吸光度的影響
圖2 標準曲線圖
精密吸取熊果酸對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL，分別置于10mL量瓶中，沸水浴揮干，各加0.2 mL新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液，1.2 mL高氯酸，混勻，密塞，在60℃水浴中反應15 min后，取出，于流水冷卻3 min，加冰醋酸定容.以相應試劑為空白，在550 nm波長處測吸光度（A）.以A A為縱坐標，熊果酸質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，繪制工作曲線（圖2）.工作曲線方程為A=0.056 7C+0.000 286，r=0.998 5，在2.32-16.24 μg/ml濃度內(nèi)線性關(guān)系良好.
2.5 精密度試驗
分別精密吸取0.1 mL，Ⅰ-Ⅲ供試品溶液各5份，按2.4項下操作，測定其吸光度.結(jié)果表明，吸光度RSD分別為0.73%，1.25%和1.51%.
2.6 穩(wěn)定性試驗
精密吸取對照品溶液0.2 mL及Ⅰ-Ⅲ供試品溶液各0.1 mL，分別按2.4項下操作，在0-60 min內(nèi)每隔5 min測定吸光度.結(jié)果在40 min以內(nèi)，吸光度變化較小，RSD分別為0.75%，1.21%，1.87%，0.52%；隨時間延長，吸光度逐漸減小，60 min時對照品吸光度的RSD為0.88%，而3份供試品溶液吸光度的RSD均大于3.0%.表明供試品溶液應在40 min以內(nèi)測定，而對照品則較穩(wěn)定，故選擇在顯色后40 min之內(nèi)測其吸光度.
2.7 重現(xiàn)性試驗
按2.1項下熱回流法、超聲波法和酶提取法分別制備供試品溶液，每種方法平行制備5份.精密吸取供試品溶液 0.1 mL，按2.4項下測定吸光度，計算總?cè)扑岬馁|(zhì)量分數(shù)，3種提取方法的RSD分別為2.16%，0.37%和1.89%.
2.8 回收率試驗
精密吸?、?Ⅲ供試品溶液各0.05 mL，分別加入與樣品中總?cè)扑岷肯喈數(shù)男芄釋φ掌啡芤?.25，0.20，0.20 mL，依法測定，計算回收率.結(jié)果平均回收率分別為 103.09%（RSD為1.06%），107.54%（RSD為1.32%），104.18%（RSD為2.70%）（n=6）.
2.9 樣品的測定
取Ⅰ-Ⅲ 供試品溶液，測定吸光度，按回歸方程計算總?cè)扑岷浚Y(jié)果見表1.
表1 柿蒂總?cè)扑岷繙y定結(jié)果（n＝5）
3 討論
1）本試驗以柿蒂主要三萜酸成分熊果酸為對照品，建立了比色法測定柿蒂總?cè)扑岷康姆椒?該法簡便可靠，可作為柿蒂質(zhì)量控制的依據(jù).
2）文獻報道主要考察5%香草醛-冰醋酸用量、高氯酸用量、水浴溫度及加熱時間對顯色的影響.本實驗發(fā)現(xiàn)，定容溶劑對熊果酸顯色體系吸光度的大小也有顯著影響，冰醋酸和乙酸乙酯是合適的定容溶劑.
3）試驗比較了熱回流提取、超聲波提取和酶法輔助提取3種不同提取方法，具體的提取條件為L9（43）正交實驗的結(jié)果.結(jié)果表明：熱回流提取法最好，提取量最高，耗時與酶法輔助提取相當；超聲提取法雖簡單省時，但提取率較低，提取不完全.因此，熱回流法是提取柿蒂總?cè)扑岬挠行Х椒?
4）樣品測定的結(jié)果可知，柿蒂富含三萜酸，含量高達5.93%，相比柿葉[3]具有更大的藥用開發(fā)價值和潛力. 5）香草醛放置過程中易被氧化，因此5%香草醛-冰醋酸臨用前要新鮮配制，以減小實驗誤差.
[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：233.
[2]熊海濤，唐志華，鄭行望.火焰原子吸收光譜法測定柿蒂中微量元素[J].理化檢驗（化學分冊），2010，46（10）：1 211-1 212.
[3]范杰平，何潮洪，傅鵬飛.柿葉中總?cè)频奶崛∫约靶芄岱蛛x、純化研究[J].中國藥學雜志，2007，42（16）：1 258-1 261.
[4]季春，張融，胡晨，等.比色法測定南蛇藤中總?cè)祁惓煞值暮縖J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（4）：909-910.
[5]馬榮，劉岱琳，殷軍.比色法測定固公果根中三萜類成分的含量[J].武警醫(yī)學院學報，2010，19（2）：114-116.
[6]蔡亞玲，阮金蘭，蘇群，等.紫背鼠尾草中總?cè)扑岬暮繙y定[J].中藥材，2008，31（5）：692-693.
（責任編輯 李健飛）
Determination of the Content of Triterpenoidic Acid in Kaki Calyx
REN Lei，F(xiàn)ENG Hai-yan，YANG Xiao-hui，LEI Ni
（School of Chemical Engineering，Shijiazhuang University，Shijiazhuang，Hebei 050035，China）
The content of triterpenoidic acid in Kaki calyx is determined.With ursolic acid as the reference，5% vanillin-acetic acid and perchloric acid as the developer，the spectrophotometric method is used for determining the triterpenoidic acid in Kaki calyx.Results show that the calibration curve is linear（r=0.9985）in the range of 2.32~ 16.24 μg/mL，and that the regression equation is A=0.0567C+0.000286.The content of triterpenoidic acid in Kaki calyx is about 5.93%and the average recovery is 103.09%.Therefore，the method is simple，accurate and reproducible，and it could be used for monitoring the quality of triterpenoidic acid in Kaki calyx.
Kaki calyx；Triterpenoidic acid；content determination
R284.1
：A
：1673-1972（2014）06-0028-03
2014-07-23
石家莊學院自然科學研究啟動基金（12YB011）
任蕾(1980-)，女，河北石家莊人，講師，主要從事天然食品抗氧化劑及其應用研究.
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任 蕾，馮海燕，楊曉輝，雷 霓
（石家莊學院 化工學院，河北 石家莊 050035）
分光光度法測定柿蒂中總?cè)扑岬暮?/p>
任 蕾，馮海燕，楊曉輝，雷 霓
（石家莊學院 化工學院，河北 石家莊 050035）
測定中藥柿蒂中總?cè)扑岬暮?，以藥材中指標性成分熊果酸為對照品，采?%香草醛-冰醋酸、高氯酸顯色后，分光光度法測定柿蒂提取液中總?cè)扑岬暮?結(jié)果顯示：三萜酸含量在2.32-16.24 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為：A=0.056 7C+0.000 286，r=0.998 5.柿蒂中總?cè)扑岷繛?.93%，加樣回收率平均為103.09%.該法操作簡便，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠，可用于柿蒂藥材中三萜酸成分的質(zhì)量控制.
柿蒂；三萜酸；含量測定；分光光度法
柿蒂（Kaki calyx）是柿樹科植物柿的干燥宿萼，主產(chǎn)于河北、河南、山東、福建等地，是一種傳統(tǒng)中藥.其味苦、性溫，有降氣、止呃之功能，常用于胃寒氣滯的呃逆[1].除此以外，柿蒂提取物還有鎮(zhèn)靜、抗心率失常和一定的抗生育作用[2].研究表明三萜酸類化合物為柿蒂主要活性成分，但其測定方法未見國內(nèi)外報道.筆者采用分光光度法對柿蒂中總?cè)扑岬暮窟M行了測定，旨在為柿蒂的應用研究提供理論依據(jù)，也可用于柿蒂及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制.
1 儀器與試劑
1.1 儀器
UV/VIS-916紫外分光光度計（澳大利亞GBC科學器材有限公司）；YJ501型超級恒溫器（上海躍進醫(yī)療器械廠）；KQ-250DE醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（河南省鞏義市予華儀器有限責任公司）；FA2204B電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）.
1.2 試劑與材料
熊果酸（批號：110742-200518，中國藥品生物制品檢定所）；纖維素酶（批號：F20101015，國藥集團化學試劑公司）；無水乙醇、冰醋酸、高氯酸、香草醛、甲醇、乙酸乙酯等均為分析純，實驗用水為石英高純水.柿蒂購于安國東方藥城中藥材有限公司.
2 方法與結(jié)果
2.1 溶液的制備
對照品溶液：準確稱取熊果酸5.8 mg，置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解定容至刻度，得0.232 mg/mL對照品溶液.
供試品溶液：取柿蒂粉末，參照文獻[3]的條件用石油醚（60-90℃）脫色，再按以下3種方法分別對柿蒂總?cè)扑徇M行提?。?/p>
熱回流法 精確稱取2 g柿蒂，加入60%乙醇溶液50 mL，于80℃恒溫水浴鍋中回流提取2.5 h.減壓過濾，濾液定容至100 mL，得樣品Ⅰ.
超聲波法 精確稱取2 g柿蒂，加入70%乙醇溶液60 mL，在60℃的溫度下超聲萃取40 min.其它操作同熱回流法，得樣品Ⅱ.
酶輔助提取法 精確稱取2 g柿蒂，加入pH5.0 HAc-NaAc緩沖溶液18 mL和6 mg纖維素酶，置于45℃恒溫水浴鍋中酶解2h.酶解結(jié)束后沸水浴滅活3min，加入42mL無水乙醇，在60℃的條件下超聲提取40min.其它操作同熱回流法，得樣品Ⅲ.
2.2 測定波長的選擇
分別移取對照品溶液0.2 mL，Ⅰ-Ⅲ供試品溶液0.1 mL于10 mL量瓶中，沸水浴揮干溶劑，各加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸1.0 mL，混勻，密塞，其余同標準曲線項下操作，在200-700 nm進行波長掃描.結(jié)果表明，對照品和供試品溶液吸收變化趨勢基本相符，且在 550 nm處均有明顯吸收，故選擇測定波長為550 nm.
2.3 顯色條件的選擇
香草醛-冰醋酸、高氯酸比色法[3-6]是測定三萜酸類化合物常用方法，但其影響因素較多，試劑的用量、反應的溫度以及反應時間等因素影響較為顯著.實驗中考察了5%香草醛-冰醋酸用量 （0.1-0.5 mL）、高氯酸用量（0.6-1.4 mL）、水浴溫度（40-80℃）及顯色時間（5-25 min）對實驗的影響，確定了最佳的顯色條件為：加入5%香草醛-冰醋酸0.2 mL，高氯酸1.2 mL，混勻，密塞，置60℃水浴中恒溫加熱15min.在此前提下，針對文獻報道中定容溶劑不統(tǒng)一的現(xiàn)象[3-6]，還考察了定容溶劑對顯色體系的影響，結(jié)果如圖1所示.5種研究溶劑中，甲醇定容時體系的吸光度最小，僅為0.03；冰醋酸與乙酸乙酯定容時，吸光度最高.考慮到冰醋酸價格比較便宜，試驗選擇冰醋酸作定容溶劑.
2.4 線性關(guān)系考察
圖1 定容溶劑對吸光度的影響
圖2 標準曲線圖
精密吸取熊果酸對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL，分別置于10mL量瓶中，沸水浴揮干，各加0.2 mL新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液，1.2 mL高氯酸，混勻，密塞，在60℃水浴中反應15 min后，取出，于流水冷卻3 min，加冰醋酸定容.以相應試劑為空白，在550 nm波長處測吸光度（A）.以A A為縱坐標，熊果酸質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，繪制工作曲線（圖2）.工作曲線方程為A=0.056 7C+0.000 286，r=0.998 5，在2.32-16.24 μg/ml濃度內(nèi)線性關(guān)系良好.
2.5 精密度試驗
分別精密吸取0.1 mL，Ⅰ-Ⅲ供試品溶液各5份，按2.4項下操作，測定其吸光度.結(jié)果表明，吸光度RSD分別為0.73%，1.25%和1.51%.
2.6 穩(wěn)定性試驗
精密吸取對照品溶液0.2 mL及Ⅰ-Ⅲ供試品溶液各0.1 mL，分別按2.4項下操作，在0-60 min內(nèi)每隔5 min測定吸光度.結(jié)果在40 min以內(nèi)，吸光度變化較小，RSD分別為0.75%，1.21%，1.87%，0.52%；隨時間延長，吸光度逐漸減小，60 min時對照品吸光度的RSD為0.88%，而3份供試品溶液吸光度的RSD均大于3.0%.表明供試品溶液應在40 min以內(nèi)測定，而對照品則較穩(wěn)定，故選擇在顯色后40 min之內(nèi)測其吸光度.
2.7 重現(xiàn)性試驗
按2.1項下熱回流法、超聲波法和酶提取法分別制備供試品溶液，每種方法平行制備5份.精密吸取供試品溶液 0.1 mL，按2.4項下測定吸光度，計算總?cè)扑岬馁|(zhì)量分數(shù)，3種提取方法的RSD分別為2.16%，0.37%和1.89%.
2.8 回收率試驗
精密吸?、?Ⅲ供試品溶液各0.05 mL，分別加入與樣品中總?cè)扑岷肯喈數(shù)男芄釋φ掌啡芤?.25，0.20，0.20 mL，依法測定，計算回收率.結(jié)果平均回收率分別為 103.09%（RSD為1.06%），107.54%（RSD為1.32%），104.18%（RSD為2.70%）（n=6）.
2.9 樣品的測定
取Ⅰ-Ⅲ 供試品溶液，測定吸光度，按回歸方程計算總?cè)扑岷浚Y(jié)果見表1.
表1 柿蒂總?cè)扑岷繙y定結(jié)果（n＝5）
3 討論
1）本試驗以柿蒂主要三萜酸成分熊果酸為對照品，建立了比色法測定柿蒂總?cè)扑岷康姆椒?該法簡便可靠，可作為柿蒂質(zhì)量控制的依據(jù).
2）文獻報道主要考察5%香草醛-冰醋酸用量、高氯酸用量、水浴溫度及加熱時間對顯色的影響.本實驗發(fā)現(xiàn)，定容溶劑對熊果酸顯色體系吸光度的大小也有顯著影響，冰醋酸和乙酸乙酯是合適的定容溶劑.
3）試驗比較了熱回流提取、超聲波提取和酶法輔助提取3種不同提取方法，具體的提取條件為L9（43）正交實驗的結(jié)果.結(jié)果表明：熱回流提取法最好，提取量最高，耗時與酶法輔助提取相當；超聲提取法雖簡單省時，但提取率較低，提取不完全.因此，熱回流法是提取柿蒂總?cè)扑岬挠行Х椒?
4）樣品測定的結(jié)果可知，柿蒂富含三萜酸，含量高達5.93%，相比柿葉[3]具有更大的藥用開發(fā)價值和潛力. 5）香草醛放置過程中易被氧化，因此5%香草醛-冰醋酸臨用前要新鮮配制，以減小實驗誤差.
[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：233.
[2]熊海濤，唐志華，鄭行望.火焰原子吸收光譜法測定柿蒂中微量元素[J].理化檢驗（化學分冊），2010，46（10）：1 211-1 212.
[3]范杰平，何潮洪，傅鵬飛.柿葉中總?cè)频奶崛∫约靶芄岱蛛x、純化研究[J].中國藥學雜志，2007，42（16）：1 258-1 261.
[4]季春，張融，胡晨，等.比色法測定南蛇藤中總?cè)祁惓煞值暮縖J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（4）：909-910.
[5]馬榮，劉岱琳，殷軍.比色法測定固公果根中三萜類成分的含量[J].武警醫(yī)學院學報，2010，19（2）：114-116.
[6]蔡亞玲，阮金蘭，蘇群，等.紫背鼠尾草中總?cè)扑岬暮繙y定[J].中藥材，2008，31（5）：692-693.
（責任編輯 李健飛）
Determination of the Content of Triterpenoidic Acid in Kaki Calyx
REN Lei，F(xiàn)ENG Hai-yan，YANG Xiao-hui，LEI Ni
（School of Chemical Engineering，Shijiazhuang University，Shijiazhuang，Hebei 050035，China）
The content of triterpenoidic acid in Kaki calyx is determined.With ursolic acid as the reference，5% vanillin-acetic acid and perchloric acid as the developer，the spectrophotometric method is used for determining the triterpenoidic acid in Kaki calyx.Results show that the calibration curve is linear（r=0.9985）in the range of 2.32~ 16.24 μg/mL，and that the regression equation is A=0.0567C+0.000286.The content of triterpenoidic acid in Kaki calyx is about 5.93%and the average recovery is 103.09%.Therefore，the method is simple，accurate and reproducible，and it could be used for monitoring the quality of triterpenoidic acid in Kaki calyx.
Kaki calyx；Triterpenoidic acid；content determination
R284.1
：A
：1673-1972（2014）06-0028-03
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