毛海姣，張小紅，廖遇平，楊振，蔣艷君

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤科，湖南 長沙 410008）

Curcumin聯(lián)合放射對人結(jié)腸癌細胞株HT29的增殖抑制作用研究

毛海姣，張小紅，廖遇平，楊振，蔣艷君

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤科，湖南 長沙 410008）

目的探討姜黃素(Curcumin,Cur)在放射線誘導(dǎo)的HT29細胞增殖及凋亡中的作用。方法常規(guī)培養(yǎng)HT29細胞，經(jīng)6 Gy放射線照射和(或)Cur處理24 h后，通過MTT比色法分析空白對照組、6 Gy單獨照射組及聯(lián)合處理組(5μmol/L姜黃素+6 Gy組、10μmol/L姜黃素+6 Gy組、20μmol/L姜黃素+6 Gy組)HT29細胞增殖率,采用流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法分析細胞凋亡率，通過Elisa實驗評價細胞中半胱氨酸蛋白酶Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性。結(jié)果Cur和6 Gy聯(lián)合處理組的細胞增殖率明顯高于空白對照組和6 Gy單獨照射組(P＜0.05)，細胞凋亡率亦顯著高于空白對照組和6 Gy單獨照射組(P＜0.01)；同時，Cur和6 Gy聯(lián)合處理組細胞中Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性亦明顯高于對照組和6 Gy單獨照射組(P＜0.05)。結(jié)論Cur可通過促進細胞凋亡相關(guān)因子活性，進而誘導(dǎo)HT29細胞凋亡，抑制其增殖，發(fā)揮HT29細胞對放射線的增敏作用，此可為結(jié)腸癌放射治療的臨床研究提供新的思路。

結(jié)腸癌；放療；姜黃素；凋亡；半胱氨酸蛋白酶

姜黃素(Curcumin，Cur)是從姜科、天南星科中某些植物的根莖中提取的一種化學(xué)成分，姜黃素由兩個鄰甲基化的酚以及一個β-二酮組成，屬于多酚類。姜黃素為橙黃色結(jié)晶粉末，不溶于水，隨著環(huán)境酸堿條件的變化可呈現(xiàn)不同的顏色，在食品生產(chǎn)中可用于膨化食品、可可制品、人造黃油及碳酸飲料等產(chǎn)品的著色劑。除了具有傳統(tǒng)作用外，大量醫(yī)學(xué)臨床研究表明姜黃素還具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗人類免疫缺陷病毒、抗腫瘤的功效，同時，對許多疾病還有預(yù)防作用[1]。最近發(fā)現(xiàn)，姜黃素在逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性和增強腫瘤細胞在放射線敏感性方面也有出色表現(xiàn)[2-3]。

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，以40歲以上為多發(fā)年齡組，發(fā)病率在世界惡性腫瘤中排第三位。手術(shù)切除是治愈結(jié)直腸癌最好的手段，而術(shù)后輔助化療能減少部分患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險，進一步提高療效，但放療的療效具有明顯的劑量依賴性，且病灶部分周邊正常組織對放療耐受能力較差，一味增加放療劑量會引起機體放射性損傷。因此，如何提高結(jié)腸癌的放療敏感性，為患者進行規(guī)范化的輔助治療，是每位臨床醫(yī)生面臨的問題。本研究擬探討姜黃素與放療聯(lián)用對人結(jié)腸癌HT29的增殖與凋亡的影響，并通過觀察聯(lián)合處理后細胞凋亡相關(guān)因子活力的變化，初步探討二者聯(lián)用的可能機制，為結(jié)腸癌的有效治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株和試劑人結(jié)腸細胞株HT29購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品(美國)。姜黃素和四甲基氮唑藍粉末(Methyl thia zolyI tetra zolium，MTT)為美國Sigma公司生產(chǎn)。Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒由浙江聯(lián)科生物技術(shù)有限提供。細胞裂解液(強型)、BCA蛋白濃度測定試劑盒和Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞HT29培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2 d傳代一次，0.25%胰蛋白酶消化。

1.2.2 照射方法在常溫下采用6MV-X線照射，照射視野10 cm×10 cm，劑量率40 cGy/min，源皮距為100 cm，均采用一次性照射至設(shè)定劑量。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖率取對數(shù)生長期的HT29細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，接種至96孔板中(每孔約5.0×103細胞/孔)，待細胞貼壁后進行實驗處理。6MV-X照射劑量參照我們預(yù)實驗結(jié)果及其他文獻[4-5]報道確定為6 Gy。聯(lián)合處理時，細胞隨機分成五組，包括：①對照組(不加任何處理)；②6 Gy單獨照射組；③5μmol/L姜黃素+6 Gy組；④10μmol/L姜黃素+6 Gy組；⑤20μmol/L姜黃素+6 Gy組。每組設(shè)6個復(fù)孔，24 h后每孔加入6 mg/ml的MTT 20μl，37℃孵育4 h，緩慢棄上清，加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，低速震蕩10 min溶解結(jié)晶，酶標儀檢測各孔在570 nm波長處的吸光度OD值，計算細胞增殖率。公式為：細胞增殖率(%)=[處理組OD值/對照組OD值× l00%]。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平取對數(shù)生長期的HT29細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，以5×104個細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后進行實驗處理。按1.2.3處理24 h后收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次，制備成濃度為4.0×106個/ml單細胞懸液，取80μl細胞懸液，加入320μl 1×Binding Buffer重懸細胞，再分別加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI溶液混勻，室溫避光孵育20 min，流式細胞儀檢測，Cellquest軟件分析細胞凋亡百分比。

1.2.5 Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性水平檢測取對數(shù)生長期的HT29細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，以5×104個細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后進行實驗處理。按1.2.3處理24 h后PBS清洗兩次，收集細胞，制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1.0×107個/ml，每107個細胞加入1 ml細胞裂解液，參照說明書方法分別提取總蛋白并測定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致后參照試劑盒方法測定Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所獲數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5版軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，組間均數(shù)比較用方差齊性檢驗和t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖率檢測結(jié)果MTT法分析6 Gy單獨照射或聯(lián)合姜黃素處理對HT29細胞增殖率的影響，如圖1所示。實驗結(jié)果表明，與對照組比較(100%)，所有處理組HT29細胞增殖率均被明顯抑制[(76.2±1.8)%、(65.3±2.3)%、(62.1±3.7)%及(47.9± 5.1)%，F(xiàn)=36.9，P＜0.01)；同時，與6 Gy單純照射組比較[(76.2±1.8)%]，各聯(lián)合處理組隨著姜黃素劑量的增加，HT29細胞增殖率隨之顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義[(65.3±2.3)%、(62.1±3.7)%及(47.9±5.1)%，F(xiàn)= 5.55，P＜0.05]。

圖1 細胞增殖率(MTT)分析6 Gy聯(lián)合不同濃度Cur處理24 h后HT29細胞增殖率的變化

2.2 細胞凋亡率檢測結(jié)果6 Gy單獨照射或聯(lián)合姜黃素處理對HT29細胞凋亡率的影響，如圖2所示。實驗結(jié)果表明，所有處理組細胞凋亡水平均顯著增加，與對照組[(3±0.41)%]比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(25.3±1.8)%、(33.8±1.1)%、(39.2±1.5)%及(55.1± 3.2)%，F(xiàn)=112.3，P＜0.01]；同時，與6 Gy單獨照射組比較(25.3%)，所有聯(lián)合處理組中細胞凋亡率隨姜黃素濃度的增加而顯著升高[(33.8±1.1)%、(39.2±1.5)%及(55.1±3.2)%，F(xiàn)=99.6，P＜0.01]，呈明顯姜黃素劑量依賴性。

圖2 流式細胞術(shù)分析6 Gy聯(lián)合Cur處理24 h后HT29細胞凋亡率的變化

2.3 凋亡相關(guān)半胱氨酸蛋白酶Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活力檢測結(jié)果6 Gy單獨照射或聯(lián)合姜黃素處理對HT29細胞中凋亡相關(guān)因子的影響，如圖3所示。實驗結(jié)果表明，與對照組比較[Caspase-3為(7.82±0.61)μmol pNA/109細胞；Caspase-6為(2.41±0.22)μmol pNA/109細胞；Caspase-9為(0.05±0.01)μmol pNA/109細胞]，所有處理組HT29細胞中三種半胱氨酸蛋白酶活力均顯著升高，其中Caspase-3為(9.89±1.8)～(25.03±2.9)μmol pNA/109細胞，Caspase-6為(4.87±0.03)～(9.45±2.41)μmol pNA/109細胞，Caspase-9為(1.30±0.02)～(4.99±0.05)μmol pNA/109細胞(F=128.4，P＜0.01)；同時，與單獨6 Gy組比較，所有聯(lián)合處理組HT29細胞中三種半胱氨酸蛋白酶活力隨姜黃素濃度的增加而隨之顯著升高(F= 24.1，P＜0.05)，呈明顯姜黃素劑量依賴性。

圖3 Elisa法分析6 Gy聯(lián)合Cur處理24 h后HT29細胞中Caspase-3，Caspase-6，Caspase-9活力變化

3 討論

放射增敏劑是一種化學(xué)或藥物制劑，當(dāng)與放療同時應(yīng)用時可以提高射線對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)。理想的放射增敏劑必須具備以下特點：①不易和其他物質(zhì)起反應(yīng)、性質(zhì)穩(wěn)定；②有效劑量沒有毒性或毒性較低；③針對腫瘤細胞有較強的放射增敏作用。使用放射增敏劑的最終目的是達到把正常組織并發(fā)癥保持在能被接受的特定水平上，而又能提高腫瘤的治愈率[6]。

本研究以人結(jié)腸癌細胞株HT29為研究對象，檢測姜黃素對6 Gy放射處理的細胞增殖和凋亡的影響，分析姜黃素作為放療增敏劑治療結(jié)腸癌的可行性。實驗結(jié)果表明：6 Gy單獨照射處理時對HT29細胞增殖率起到了一定的抑制作用，當(dāng)6 Gy照射與5～20μmol/L的Cur聯(lián)用處理時HT29細胞增殖率則明顯低于6 Gy單獨照射組。筆者通過流式細胞術(shù)細胞凋亡分析實驗進一步證實了6 Gy與姜黃素聯(lián)用時姜黃素表現(xiàn)出了顯著的增敏作用。ELISA研究結(jié)果表明，5～20μmol/L的姜黃素與6 Gy聯(lián)用時顯著誘導(dǎo)了各聯(lián)合組細胞中半胱氨酸蛋白酶Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9的活性。因此，結(jié)合MTT和細胞凋亡結(jié)果，提示在本實驗體系中姜黃素通過促進細胞凋亡率，降低了結(jié)腸癌細胞HT29的增殖率，符合放療增敏劑篩選原則[7]，相關(guān)分子機制有待進一步研究。

綜上所述，5～20μmol/L的姜黃素對人結(jié)腸癌細胞株HT29具有明顯的放療增敏作用，通過促進凋亡相關(guān)因子的表達而使細胞對射線誘導(dǎo)凋亡的敏感性提高，為今后結(jié)腸癌的放射治療研究提供了一個新的治療思路。

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Influence of curcumin combined with radiotherapy on the proliferation and apoptosis of HT29 cells.

MAO Hai-jiao,ZHANG Xiao-hong,LIAO Yu-ping,YANG Zhen,JIANG Yan-jun.Department of Oncology,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410008,Hunan,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of curcumin(Cur)on the proliferation and apoptosis of HT29 cells induced by radiotherapy.MethodsHT29 cells were routinely cultured and treated with 6 Gy and(or)Cur for 24 h∶control group,6 Gy singly used group,6 Gy combined with Cur group(5μmol/L Cur+6Gy,10μmol/L Cur+6Gy, 20μmol/L Cur+6Gy).Then MTT assay,flow cytometer,annexin V-FITC/PI double staining and elisa assay were performed to evaluate the proliferating ratio,apoptotic ratio and assess the Caspase-3,Caspase-6 and Caspase-9 activities in HT29 cells.ResultsThe cell proliferating ratio of HT29 cells in 6 Gy combined with Cur group was significantly decreased compared to the corresponding cells in either control or 6 Gy singly used groups(P＜0.05),and the apoptotic levels of HT29 cells were significantly increased compared to the corresponding cells in either control or 6 Gy singly used groups(P＜0.01).Simultaneously,the Caspase-3,Caspase-6 and Caspase-9 activities in the cells in 6 Gy combined with Cur group were increased compared to the corresponding cells in control and 6 Gy singly used groups(P＜0.05).ConclusionCur can increase the sensitivity of HT29 cells in response to 6 Gy through induction of apoptosis-associated factors and increasing apoptosis.Thus,our study may provide a new concern for the clinical treatment of colon carcinoma.

Colon carcinoma;Radiotherapy;Curcumin;Apoptosis;Cysteine protease

R735.3+5

A

1003—6350(2014)19—2816—04

2014-04-14)

毛海姣。E-mail：mhj.78@163.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1110