賈 晗，付紹智*，陳洪源，李琳莉，郭芳琴

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 萬(wàn)州 404120；2.重慶三峽中藥研究所，重慶 萬(wàn)州 404120；3.重慶綠萊生物科技有限公司，重慶 開(kāi)縣 405400)

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太白貝母不同器官愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)研究

賈 晗1，2，付紹智1，2*，陳洪源1，2，李琳莉1，2，郭芳琴3

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 萬(wàn)州 404120；2.重慶三峽中藥研究所，重慶 萬(wàn)州 404120；3.重慶綠萊生物科技有限公司，重慶 開(kāi)縣 405400)

分別選用不同生長(zhǎng)年齡的太白貝母鱗莖、種子和幼嫩葉片為實(shí)驗(yàn)材料，探索研究不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)其不同器官的愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽的發(fā)生情況。結(jié)果表明，不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母種子的誘導(dǎo)發(fā)芽效果差別不大；MS+NAA 1.0mg/L +6-BA 6mg/L的配方較適合太白貝母鱗片分化；MS+NAA 1.0mg/L +6-BA 2mg/L的配方較適合太白貝母幼葉分化。

太白貝母；組織培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)研究

太白貝母(FritillariataipaiensisP.Y. Li.)為百合科貝母屬多年生草本植物，以3～5年生植物地下鱗莖入藥，是2010年版《中國(guó)藥典》川貝母藥材新收載的基源品種之一[1]。近年來(lái)，川貝母的需求量不斷增加，其價(jià)格一路飆升，但由于川貝母的主要來(lái)源暗紫貝母對(duì)氣候、溫度、土質(zhì)等生長(zhǎng)環(huán)境條件要求特殊，人工栽培很困難，商品藥材全靠采挖野生資源，過(guò)度采挖造成資源日趨減少并面臨枯竭[2]。為了滿足市場(chǎng)對(duì)川貝母的需求，課題組開(kāi)展了對(duì)三峽地區(qū)地產(chǎn)藥材太白貝母不同組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)實(shí)踐，探索太白貝母的組培技術(shù)，為其快速繁育和種苗工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)貝母類鱗莖組織培養(yǎng)方面的研究很多，但有關(guān)太白貝母的組織培養(yǎng)技術(shù)研究報(bào)道比較少。為探索太白貝母組織培養(yǎng)的方法，課題組分別選用了不同生長(zhǎng)年齡的太白貝母鱗莖、種子和幼嫩葉片為實(shí)驗(yàn)材料，研究不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)其不同器官的愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽的發(fā)生情況，期望能夠?yàn)樘棕惸府a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采集自重慶市巫溪縣蘭英鄉(xiāng)黃草坪太白貝母種植基地的6年生種子，2～4年生的太白貝母(FritillariataipaiensisP.Y. Li.)新鮮鱗莖及幼嫩葉片。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分別將太白貝母的新鮮鱗莖、成熟種子及幼嫩葉片經(jīng)過(guò)消毒處理后，接種至不同激素及濃度組合的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其愈傷組織的形成及分化情況。

1.3 培養(yǎng)基配制

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，初代培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基添加蔗糖40g/L，瓊脂4.5%，pH值為5.8，分別按照不同比例添加6-BA、NAA、KT等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，L-半胱氨酸、VC等抗褐化有機(jī)物以及活性炭。所有培養(yǎng)基均在121℃條件下高壓滅菌20min。

1.4 供試材料處理

1.4.1 鱗莖處理 取無(wú)病蟲害的太白貝母鱗莖，去掉最外面一層腐爛、褐化的鱗片，再將根系切除。先用清水沖洗去鱗莖表面的泥土，然后將鱗瓣剝離，放入稀的洗潔精溶液中浸泡10min，流水沖洗10～15min，之后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，先用70%酒精浸泡2～3min，無(wú)菌水清洗3～4次，浸入0.1%升汞液8～10min，無(wú)菌水沖洗7～8次，之后用無(wú)菌刀片將鱗莖切成5mm左右厚度的小片備用。

1.4.2 種子處理 取新采收的太白貝母種子300粒，先用70%酒精浸泡2min，無(wú)菌水清洗3次，之后浸入0.1%升汞液8～10min，無(wú)菌水沖洗7～8次，濾干水分備用。

1.4.3 嫩葉處理 取新長(zhǎng)出的太白貝母嫩葉若干，先用自來(lái)水洗凈，再用稀的洗潔精溶液浸泡10min，流水沖洗10min，之后用75%酒精處理葉片30s，無(wú)菌水沖洗3次，無(wú)菌濾紙吸干水分后，用無(wú)菌剪刀剪成1～2mm寬的小片備用。

1.5 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

分別將無(wú)菌處理后的太白貝母鱗片、種子和嫩葉接種于不同激素配比組合的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)1 000lux，溫度20℃，光照10h。接種10d后統(tǒng)計(jì)污染率，45d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

2 結(jié)果與分析

由于接種后，外植體感染率在50%以上，為了體現(xiàn)實(shí)際誘導(dǎo)效果，在計(jì)算發(fā)芽率時(shí)，將感染的外植體剔除后進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式：出芽率=[出芽外植體數(shù)/(接種外植體總數(shù)-感染外植體數(shù))]×100%。

2.1 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母新鮮鱗莖誘導(dǎo)效果

經(jīng)過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，選擇以下不同濃度6-BA與NAA組合進(jìn)行太白貝母鱗莖的愈傷組織誘導(dǎo)，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母鱗莖愈傷組織誘導(dǎo)效果

圖1 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母麟莖愈傷組織誘導(dǎo)效果比較

從表1和圖1可以看出，1mg/L NAA與6mg/L 6-BA組合對(duì)太白貝母鱗莖的愈傷組織誘導(dǎo)效果較好，但在愈傷組織形成的同時(shí)，總計(jì)55.6%以上的接種組織出現(xiàn)了細(xì)菌感染，使后續(xù)的轉(zhuǎn)代培養(yǎng)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行。

2.2 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母種子誘導(dǎo)效果

經(jīng)過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，選擇以下不同濃度6-BA與NAA組合進(jìn)行太白貝母種子的發(fā)芽誘導(dǎo)，結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

表2 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母種子誘導(dǎo)效果

圖2 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母種子誘導(dǎo)效果比較

從表2和圖2可以看出，不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母種子的誘導(dǎo)發(fā)芽效果差別不大。在愈傷組織形成的同時(shí)，總計(jì)57.3%以上的接種組織出現(xiàn)了細(xì)菌感染，使后續(xù)的轉(zhuǎn)代培養(yǎng)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行。

2.3 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母幼葉的誘導(dǎo)效果

經(jīng)過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，選擇以下不同濃度6-BA與NAA組合進(jìn)行太白貝母幼葉的愈傷組織誘導(dǎo)，結(jié)果見(jiàn)表3、圖1。

表3 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母幼葉的愈傷組織誘導(dǎo)效果

圖3 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母幼葉愈傷組織誘導(dǎo)效果比較

從表3和圖3可以看出，1mg/L NAA與2mg/L 6-BA組合對(duì)太白貝母幼葉的愈傷組織誘導(dǎo)效果較好，分化出的不定芽葉色濃綠，葉片展開(kāi)，芽健壯。但在愈傷組織形成的同時(shí)，55.4%的接種組織出現(xiàn)了細(xì)菌感染，使后續(xù)的轉(zhuǎn)代培養(yǎng)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行。

3 討論

經(jīng)過(guò)探索實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)不同太白貝母器官的愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。由表1可知，隨著6-BA濃度提高，鱗片的分化率也隨之提高，當(dāng)6-BA濃度由2mg/L增加至6mg/L時(shí)，其出芽率達(dá)到最高；由表2可知，不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)太白貝母種子的誘導(dǎo)發(fā)芽效果差別不大；由表3可知，隨著6-BA濃度提高，幼葉的分化率反而出現(xiàn)下降。因此，通過(guò)本組試驗(yàn)對(duì)比，分別得出適合太白貝母鱗片分化的優(yōu)化組合為MS+NAA1.0mg/L +6-BA 6mg/L；適合太白貝母幼葉分化的優(yōu)化組合為MS+NAA 1.0mg/L +6-BA 2mg/L。但是，由于愈傷組織培養(yǎng)到后期，感染率非常大，所以后續(xù)的轉(zhuǎn)代培養(yǎng)未能進(jìn)行。分析原因，可能是太白貝母鱗莖內(nèi)存在某種內(nèi)生細(xì)菌，在培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)了大量增殖，影響到愈傷組織的形成，這有待于進(jìn)一步探索研究。

[1] 姜榮蘭，張?zhí)煊?，王健生，?川貝母主流品種原植物的地理分布及藥材研究[J].四川中草藥研究，1992(33-34):18

[2] 李隆云,周裕書,代敏,等.暗紫貝母鱗莖再生組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].中國(guó)中藥雜志,1995,20(2):78.

[3] 高山林,朱丹妮,等.暗紫貝母鱗莖器官培養(yǎng)生長(zhǎng)特征和生物堿積累的研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1992,23(3):144-147.

[4] 陳敏,陳和榮,鐘鳳林,等.川貝母組織培養(yǎng)的研究[J].中國(guó)中藥雜志,1995,20(8):414.

[5] 朱丹妮,蔣瑩,陳婷,等.組織培養(yǎng)川貝母化學(xué)成分和藥理作用的研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1992,23(2):118-121.

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

2014-06-17

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ092104)

賈晗(1984-)，女，重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校講師，研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源學(xué)、中藥科普等。

付紹智(1965-)，男，重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校副教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開(kāi)發(fā)利用。E-mail：fushaozhi@sina.com。

S567.231

A

1673-2197(2014)19-0011-03