吳 洋，王 洋，馬學(xué)琴

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué) 回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750004；3.銀川市口腔醫(yī)院，寧夏 銀川 750004)

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苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究

吳 洋1,2，王 洋3，馬學(xué)琴1,2

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué) 回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750004；3.銀川市口腔醫(yī)院，寧夏 銀川 750004)

目的：研究苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用并初步探討其機(jī)制。方法：采用♂昆明小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、陽性對照(硫普羅寧30 mg/kg)組、苦參堿高、中、低劑量(80 mg/kg、40 mg/kg和20 mg/kg)組，分別灌胃給藥6天，于第6天末次給藥2h后除正常對照組外，其余各組一次性灌胃給予50%乙醇(5 g/kg)。乙醇處理12h后測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性及肝臟組織勻漿丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽還原酶(GSH-px)的含量，并進(jìn)行肝組織病理學(xué)切片檢查及Ridit分析。結(jié)果：與模型組比較，苦參堿各劑量組血清AST、ALT活力和肝組織MDA含量顯著降低(P<0.05)；肝組織SOD、GSH-Px 活力均升高(P<0.05)；苦參堿高、中劑量組R值顯著于模型組(P<0.05)。結(jié)論：苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與抗氧化應(yīng)激相關(guān)。

苦參堿；酒精；急性肝損傷；谷草轉(zhuǎn)氨酶；谷丙轉(zhuǎn)氨酶；氧化應(yīng)激

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是長期過度飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，是肝硬化的最主要病因之一[1]。隨著近年來我國飲酒人群不斷增加，ALD的發(fā)病率和死亡率也逐年增高，已成為繼病毒性肝炎之后的第二大肝病[2]。目前，ALD的治療仍然是以戒酒為主，尚無特效藥物，且支持治療作用有限。尋找預(yù)防和治療酒精性肝損傷的藥物已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一?？鄥A(matrine)是從寧夏特色回藥材苦豆子(SophoraalopecurodiesL)中提取的主要生物堿之一，具有諸多藥理作用。研究表明，苦參堿對內(nèi)毒素和缺血再灌注致肝損傷具有保護(hù)作用[3]。酒精可參與肝細(xì)胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)，其在肝中的過量代謝可產(chǎn)生大量自由基，促進(jìn)肝細(xì)胞的脂肪變性、壞死和炎細(xì)胞浸潤從而導(dǎo)致肝損傷[4]。酒精所致肝損傷的機(jī)制與乙醇及其代謝產(chǎn)物對肝細(xì)胞的氧化損傷和降低抗氧化物水平有關(guān)[5-6]。本研究旨在觀察苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用及初步作用機(jī)制，為其防治急性酒精性肝損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

清潔級♂昆明種小鼠共60只，體重18～22g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK(寧)2011-0003。

1.2 試劑

苦參堿(寧夏紫荊花藥業(yè)有限公司，純度99.8%，批號90110301)；硫普羅寧( 河南省新誼藥業(yè)股份有限公司，批號100909)；50%乙醇(分析純，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司，批號20101020)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110316)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST) 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110309)；丙二醛(MDA) 試劑(南京建成生物工程研究所，批號20110309)；超氧化物歧化酶(SOD) 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110315); 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110307); 考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110303);冰醋酸(北京化工廠，批號20081018)。

1.3 儀器

VIS-7220N 可見分光光度儀(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)；低溫超速離心機(jī)(日本東京Hongo . BUNKYO-KU)；SHHW21三用電熱恒溫水浴箱(北京長遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；MERRLERAE240型電子分析天平(梅特勒-托利儀器上海有限公司)。

2 方法

2.1 造模及給藥

60只♂昆明小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、陽性對照(硫普羅寧30 mg/kg)組、苦參堿高、中、低劑量(80 mg/kg、40 mg/kg和20 mg/kg)組。正常組和模型組給予蒸餾水，陽性藥物組和苦參堿各劑量組給予對應(yīng)劑量藥物灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)6天。根據(jù)文獻(xiàn)[7]，于第6天灌胃2h后，模型組、陽性對照組及苦參堿各劑量組一次性灌胃給予體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇(分析純，以蒸餾水稀釋)，灌胃量為12.5mL/kg，折合乙醇劑量為5g/kg[乙醇劑量(g/kg)=乙醇密度(0.8g/mL)×乙醇體積(12.5mL/kg)×乙醇濃度]，正常組給予蒸餾水灌胃。

2.2 樣本采集及指標(biāo)檢測

小鼠于末次給藥后禁食12 h，自由飲水。采用眼球后靜脈叢取血法獲得血標(biāo)本后于4℃靜置2 h，1 500 r /min 離心10 min，取上清液測定ALT、AST 活性;取肝組織約0.3g，剪碎后按1∶9比例加入生理鹽水，冰浴中制備肝臟組織勻漿，測定肝勻漿中MDA 含量以及SOD、GSH-Px 活性。同時取肝左葉距邊緣0.5cm 處的一小塊肝組織，用10% 甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，行HE 染色，光鏡下觀察肝組織脂肪變性程度和炎癥、壞死情況。依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組《酒精性肝病診療指南：2010年1月(修訂)》進(jìn)行肝臟脂肪變性評分分級[8]。按肝細(xì)胞脂肪變性占所獲取肝組織標(biāo)本量的范圍，分為4度(F0-4)：F0:<5%的脂肪細(xì)胞脂肪變性；F1:5%～30%的肝細(xì)胞脂肪變性；F2:31%～50%的肝細(xì)胞脂肪性變；F3:51%～75%的肝細(xì)胞脂肪變性；F4:>75%的肝細(xì)胞脂肪變性。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 苦參堿對急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST 活性的影響

模型組血清ALT、AST 活性較正常對照組明顯增加(P<0.01)，苦參堿可明顯降低模型小鼠血清ALT、AST 活性(P< 0.05，P<0.01) 。具體見表1。

表1 苦參堿對急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響 (n=10,±s)

注：與正常對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

3.2 苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷肝組織MDA、SOD、GSH-Px活性的影響

模型組肝組織MDA含量較正常對照組明顯增加(P<0.01)，SOD 和GSH-PX 活性較正常對照組顯著降低(P<0.01)，苦參堿各劑量組可明顯降低模型小鼠肝組織MDA含量(P<0.01)，中、高劑量組可明顯提高模型小鼠肝組織SOD、GSH-Px 活性(P<0.01)。見表2。

表2 苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷肝組織MDA、SOD、GSH-Px活性的影響 (n=10,±s)

注：與正常對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，##P<0.01。

3.3 苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷肝組織病理變化的影響

光鏡下，正常對照組可見肝小葉及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞條索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，界限清晰，病理脂肪變?yōu)镕0度。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹明顯，胞漿透明，胞質(zhì)疏松，可見圓形脂肪空泡幾乎占據(jù)所有肝組織及炎細(xì)胞浸潤，局部細(xì)胞核溶解壞死，病理脂肪變以F4度為主?？鄥A低劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)尚存在，其中可見局部脂肪空泡，肝細(xì)胞腫脹減輕，脂肪變以F2和F3度為主?？鄥A中、高劑量組小鼠肝小葉基本正常，肝竇輪廓整齊，細(xì)胞分界清晰，肝細(xì)胞無明顯空泡及疏松，少見炎細(xì)胞浸潤，脂肪變?yōu)镕1和F2度。由于病理多分類變量按F0-F5度由輕到重排列，Ridit平均值低于0.05，表示病理變化較輕。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示苦參堿高、中劑量組小鼠肝損傷程度較模型組均有所減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示苦參堿可以減輕乙醇致小鼠急性肝損傷。見圖1和表3。

圖1 苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷肝組織病理變化的影響(×40)

組別劑量(mg/kg)數(shù)量脂肪變積分F0(<0．5%)F1(5%～30%)F2(31%～50%)F3(51%～75%)F4(>75%)R值正常對照組—101000000．083##模型組—10000370．862苦參堿(Matrine)8010044200．453##4010034210．518#2010005320．653陽性對照組(硫普羅寧)3010053200．430##總計(jì)—6010121612100．500

注：與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

4 討論

酒精性肝病(ALD)是全球范圍內(nèi)影響人類健康的重要疾病，短時間內(nèi)大量攝入乙醇可導(dǎo)致肝臟發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，即急性酒精性肝損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)采用50%乙醇灌胃誘發(fā)小鼠急性肝損傷模型，該模型與人急性酒精性肝損傷相似[7]。動物體內(nèi)ALT和AST是肝細(xì)胞內(nèi)主要功能酶，它們廣泛存在于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝組織損傷及壞死時，肝細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)被破壞，膜流動性失常，酶從細(xì)胞釋放入血，血清中ALT、AST含量就會升高，故ALT、AST的高低可用來判斷其肝損傷的程度[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦參堿可使乙醇致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST水平顯著降低。說明苦參堿對乙醇致急性肝損傷小鼠肝功能具有一定保護(hù)作用。

研究表明，乙醇誘導(dǎo)的急性肝損傷機(jī)制與乙醇及其代謝產(chǎn)物引起的氧化應(yīng)激密切相關(guān)，被認(rèn)為是最重要的發(fā)病機(jī)制之一[5,6,11]。氧化應(yīng)激主要是過多氧自由基(ROS)與抗氧化酶系統(tǒng)(SOD和GSH-px等)的不平衡所致?？寡趸傅幕钚苑从硻C(jī)體對氧自由基清除能力的高低，故可通過提高機(jī)體抗氧化酶活性，來減少氧自由基的增多以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。而增多的氧自由基與生物大分子發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成生物膜損傷并使產(chǎn)生的過氧化物丙二醛(MDA)的含量升高。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量高低也能夠在一定程度上反映肝臟受損情況[11-12]。肝臟是乙醇代謝的主要場所，飲酒后約90%的乙醇由肝臟的乙醇代謝系統(tǒng)，即乙醇脫氫酶(ethanol dehydrogenase, ADH)和乙醇氧化系統(tǒng)(microsomal ethanol oxidizing system, MEOS)代謝清除。體內(nèi)乙醇大部分由ADH代謝轉(zhuǎn)化為乙醛，再由乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)催化生成無毒的乙酸，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)生成能量、CO2和H2O。而乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸的速度較慢，容易蓄積在體內(nèi)。乙醛可與肝細(xì)胞中蛋白、DNA形成加合物影響蛋白質(zhì)的變構(gòu)，使酶失活使肝細(xì)胞功能受損[13]。同時乙醛也可通過黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)變?yōu)槌趸锖脱踝杂苫箼C(jī)體ROS增多，引發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致MDA增高，SOD、GSH-px大量消耗，肝臟清除自由基能力下降[14]。由此可見，氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化受阻在酒精性肝損傷的過程中意義重大，而維持機(jī)體內(nèi)SOD和GSH-px的活性，就能夠清除代謝產(chǎn)生的多量自由基，進(jìn)而保護(hù)肝臟。因此，維持機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組與正常組比較，血清ALT、AST活性明顯增加，而肝臟組織SOD及GSH-px明顯降低，MDA增多。說明急性酒精性肝損傷小鼠模型的建立是成功的。而苦參堿各劑量組和模型組比較，血清ALT、AST活性明顯降低，肝臟組織SOD和GSH-px活性增加， MDA含量降低，表明苦參堿可通過提高肝臟組織中SOD及GSH-px活性，降低肝細(xì)胞內(nèi)的ROS，從而穩(wěn)定細(xì)胞膜，降低血清中轉(zhuǎn)氨酶含量，進(jìn)而減輕肝損傷，保護(hù)肝細(xì)胞。此外，組織病理學(xué)結(jié)果也表明苦參堿各組肝小葉及肝細(xì)胞病理改變較模型組明顯好轉(zhuǎn)，說明苦參堿可減輕乙醇致小鼠急性肝損傷。

綜上所述，苦參堿對乙醇致小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與降低血清ALT、AST和肝臟組織中MDA含量，增加肝臟組織中SOD及GSH-px活性及抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Protective Effects of Matrine on Acute Ethanol-Induced Liver Injury in Mice

Wu Yang1,2,Wang Yang3, Ma Xueqin1,2

(1.Department of Pharmacology, NingXia Medical University, Ningxia 750004, China;2.Ningxia Engineering & Technology Research Center for Modernization of Hui Medicine, Ningxia 750004, China;3.Yinchuan Stomatology Hosptial, Ningxia 750004 China)

Objective:To investigate the protective effect of matrine on acute ethanol-induced liver injury in mice and its mechanism. Methods:Male Kunming mice were randomLy divided into the control group, model group, positive control group (Tiopronin) and different concentration of matrine (80 mg/kg, 40 mg/kg and 20 mg/kg) and irrigation stomach respectively for 6 days. The mice were induced alcohol acute liver damage by ethanol (50%，5 g/kg) at the last administration beside control group. After 12 hours ethanol treatment, the determination serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT); MDA, SOD and GSH-px in liver tissue were detected. Pathological changes in liver tissue were checked by the Ridit analysis method.Results:The determination of liver index, activity of serum AST and ALT and MDA in liver tissue homogenate were significantly reduced(P<0.05)and the activity of SOD and GSH-px in liver tissue were increased(P<0.05) in each dose of matrine. The value of R in matrine high and middle doses were decreased (P<0.05). Conclusion:Matrine has a significant protection against acute ethanol induced hepatic injury, and the mechanism may be associated with anti-oxidative activities.

Matrine; Ethanol; Acute Liver Injury; AST; ALT; Oxidative Stress

2014-07-23

寧夏醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究基金資助面上項(xiàng)目(XM200910)

吳洋(1979-)，女，博士，寧夏醫(yī)科大學(xué)講師，研究方向?yàn)榧?xì)胞分子藥理學(xué)。E-mail: charming_wuyang@163.com。

R285

A

1673-2197(2014)19-0006-03