姜 鴻，王光函，尤獻(xiàn)民，趙金明

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

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清血通脈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

姜 鴻，王光函，尤獻(xiàn)民，趙金明*

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

目的：研究制定清血通脈顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用TCL法對(duì)成品中枸杞子、柴胡、甘草進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC法對(duì)成品中丹參酮ⅡA進(jìn)行含量測(cè)定，色譜柱為Hypersil-C18(4.6mm×200mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(70∶30)，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm。結(jié)果：薄層斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專屬性強(qiáng)；丹參酮ⅡA在0.033～0.165mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999)，平均加樣回收率為98.63%(RSD=1.5%)。結(jié)論：HPLC法檢測(cè)清血通脈顆粒質(zhì)量方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，能有效控制清血通脈顆粒質(zhì)量。

清血通脈顆粒；TCL；HPLC；丹參酮ⅡA；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

清血通脈顆粒是由丹參、枸杞子、柴胡、甘草片等七味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有化痰祛瘀之功效，主要用于治療痰濁瘀滯型血脂癥，療效確切。為保證本品質(zhì)量，本文對(duì)其成品質(zhì)量控制方法進(jìn)行研究，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC-10ATvp液相泵；SPD-10Avp紫外檢測(cè)器(日本島津)；色譜柱：Hypersil-C18(4.6mm×200mm，5μm)(大連依利特)。

1.2 試劑

丹參酮ⅡA對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院，批號(hào)：110766-200619)；甲醇為色譜純，水為二次蒸餾水；清血通脈顆粒樣品(規(guī)格：10g/袋，批號(hào)：20130901、20130902、20130903)及不含被測(cè)藥材陰性樣品，均由遼寧省中醫(yī)藥研究院藥學(xué)研究室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層定性鑒別

2.1.1 枸杞子薄層定性鑒別 取本品10g，研細(xì)，加水50mL，加熱煮沸15min，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯提取2次，每次40mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，作為供試品溶液。另取枸杞子對(duì)照藥材0.5g，加水35mL，按同樣方法制成對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2010版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2～5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以乙酸乙酯—三氯甲烷—甲酸(3∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)檢視。與對(duì)照藥材色譜的相應(yīng)位置，供試品色譜顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 枸杞子薄層色譜

2.1.2 柴胡薄層定性鑒別 取本品10g，研細(xì)，加水50mL，加熱煮沸15min，放冷，離心，取上清液，用乙醚提取2次，每次30mL，棄去乙醚液，水層用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次20mL，棄去氨試液，正丁醇液減壓回收至干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取柴胡皂苷a對(duì)照品，加甲醇制成1mg·mL-1溶液，作為對(duì)照品。按薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2010版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液5～10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以10℃下過夜放置的三氯甲烷—甲醇—水(13∶7∶2)下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%對(duì)二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇溶液(1→10)，于70℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。置紫外光燈(365nm)下檢視，與對(duì)照品色譜的相應(yīng)位置，供試品色譜顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖2。

圖2 柴胡薄層色譜

2.1.3 甘草薄層定性鑒別 取本品10g，研細(xì)，加氨水5mL與80%乙醇50mL回流提取30min，放冷，濾過，濾液蒸至近干，殘?jiān)?.5mol/L硫酸的50%乙醇溶液100mL溶解，回流提取1h，放冷，選用石油醚(30～60℃)提取2次，每次50mL，合并石油醚提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，作為供試品溶液。另取甘草次酸為對(duì)照品，加甲醇制成1mg·mL-1溶液，作為對(duì)照品。按照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2010版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10～20μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(30～60℃)—乙酸乙酯—丙酮—甲酸(30∶6∶5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置，供試品色譜顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖3。

圖3 甘草薄層色譜

2.2 丹參酮ⅡA含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-水(70∶30)，柱溫：25℃，流速：1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)，精密稱取0.5g，加25mL甲醇，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱定重量，加甲醇補(bǔ)充減失重量，混勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)確定 吸取丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液(1mg·mL-1)50μL，加甲醇稀釋至5mL，選用Agilent-8453紫外分光光度計(jì)于200～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明：丹參酮ⅡA對(duì)照品稀釋溶液在270nm附近有最大吸收峰，因此選擇270nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.4 線性關(guān)系考查 精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品13.20mg，置10mL容量瓶，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1mL，置100mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液(丹參酮ⅡA對(duì)照品濃度為13.2μg·mL-1)。分別精密吸取丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液(13.2μg·mL-1)2.5、5、7.5、10.0、12.5μL(丹參酮ⅡA含量分別為0.033、0.066、0.099、0.132、0.165μg)，注入液相色譜儀，測(cè)定丹參酮ⅡA峰面積，以丹參酮ⅡA對(duì)照品含量為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，按最小二乘法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.182 5×10-7X-0.007 4，r=0.999。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定丹參酮ⅡA峰面積，平行6次，計(jì)算RED為1.14%，表明重復(fù)性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次本品，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，平行6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)制取供試品溶液，精密吸取供試液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定丹參酮ⅡA峰面積，結(jié)果顯示：RSD為1.4%，表明重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的本品細(xì)粉(批號(hào)20130901，丹參酮ⅡA含量為0.369mg·g-1)0.25g，精密稱定，平行9份，分別加入丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液(0.095mg·mL-1)0.8、1.0、1.2mL，分別按“2.2.2”項(xiàng)制取供試品溶液，精密吸取供試液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定丹參酮ⅡA峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示：平均回收率為98.63%，RSD=1.5%。見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.2.8 專屬性試驗(yàn) 分別取丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液、供試液、無(wú)丹參陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果表明：陰性對(duì)照液無(wú)干擾。見圖4。

2.2.9 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)樣品各1袋，研細(xì)，分別取0.5g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)供試液制備方法，測(cè)定丹參酮ⅡA含量。見表2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果 (mg/袋)

3 討論

參照中華人民共和國(guó)藥典[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[2-3]，本研究反復(fù)比較供試品溶液制備方法和薄層展開條件，優(yōu)化本品枸杞子、柴胡、甘草的TCL鑒別條件。同時(shí)對(duì)TCL方法耐用性進(jìn)行考察，對(duì)不同溫度、濕度環(huán)境及不同薄層板(手工鋪制、自動(dòng)鋪制、市售預(yù)制板)的展開效果進(jìn)行比較，結(jié)果良好，表明本研究薄層鑒別方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)便。

圖4 清血通脈顆粒HPLC色譜

根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典“丹參”項(xiàng)[1]，丹參酮ⅡA測(cè)定流動(dòng)相為甲醇—水(75∶25)，研究顯示本品在該系統(tǒng)條件下供試品溶液的丹參酮ⅡA色譜峰與相鄰雜志峰分離不佳。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]，調(diào)整流動(dòng)相比例，使其完全分離，且陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾?？紤]盡量節(jié)省保留時(shí)間，因此本試驗(yàn)流動(dòng)相確定為甲醇—水(70∶30)。

本試驗(yàn)按同一供試品溶液在不同品牌色譜柱(Hypersil C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Diamonsil C18、kromasil)以及同一品牌不同長(zhǎng)度色譜柱條件測(cè)定，結(jié)果顯示：除丹參酮ⅡA色譜峰停留時(shí)間存在差異外，丹參酮ⅡA含量不受影響。說明該方法重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:232-263.

[2] 左懷榮.銀柴感冒膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,32(4):343-345.

[3] 陶君,黃懷鵬.梔芩清熱軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].天津中醫(yī)藥,2005,22(4):334-335.

[4] 張亞中,金斌,黃麗丹,等.HPLC測(cè)定128批丹參舒心膠囊中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量及結(jié)果分析[J].中成藥,2011,33(1):65-69.

[5] 劉剛,張啟明,張捷,等.高效液相色譜法測(cè)定丹參酮滴耳液中4種丹參酮成分含量[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2004,39(3):218-220.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

2014-09-14

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011408004)；沈陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(F11-154-9-00)

姜鴻(1975-)，遼寧省中醫(yī)藥研究院副研究員，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

趙金明(1966-)，遼寧省中醫(yī)藥研究院研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾难芩幚砑翱共《拘滤?。E-mail:lnzhaojinming0902@126.com

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1673-2197(2014)24-0022-03