歐陽(yáng)資章,朱少華,鄔淑紅,陳 方,劉曉萍,肖誠(chéng)胤

(1.清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院,廣東 清遠(yuǎn) 511515;2.中山大學(xué) 藥學(xué)院,廣東 廣州 510006;3.清遠(yuǎn)市婦幼保健院,廣東 清遠(yuǎn) 511500)

?

山楂酸保護(hù)順鉑致人腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用機(jī)制研究

歐陽(yáng)資章1,朱少華2,鄔淑紅3,陳 方1,劉曉萍1,肖誠(chéng)胤1

(1.清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院,廣東 清遠(yuǎn) 511515;2.中山大學(xué) 藥學(xué)院,廣東 廣州 510006;3.清遠(yuǎn)市婦幼保健院,廣東 清遠(yuǎn) 511500)

目的：研究山楂酸對(duì)順鉑(cisplatin)致近段人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)共分四組：空白組、順鉑組、山楂酸保護(hù)組、維生素E保護(hù)組；培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，加入順鉑及預(yù)先加入山楂酸或維生素E進(jìn)行孵育，采用試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA及GSH含量，采用熒光素DCFH-DA探針法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡及壞死情況。結(jié)果：經(jīng)山楂酸干預(yù)后，HK-2細(xì)胞內(nèi)MDA明顯減少，GSH明顯增加，表明山楂酸能顯著抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果表明山楂酸對(duì)順鉑所致的細(xì)胞毒性有保護(hù)作用。結(jié)論：山楂酸對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

山楂酸；順鉑；活性氧；作用機(jī)制

順鉑是目前臨床常用的有效化療藥物，廣泛用于各種實(shí)體瘤的治療，但劑量依賴性的腎毒性副作用也極大地限制其應(yīng)用[1]。因此，如何有效防治順鉑的腎毒性是抗腫瘤化療過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。研究[2-3]表明，氧化應(yīng)激損傷可能是導(dǎo)致順鉑腎毒性的重要原因，表現(xiàn)為順鉑可引起脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物含量增多、抗氧化酶活性下降等。山楂酸是一種五環(huán)三萜酸，存在于山楂，紅棗等多種植物，研究表明山楂酸具有多種藥理活性，如抗癌[4]、抗氧化[5-6]、抗艾滋病[7]、抗菌[8]、抗2型糖尿病[9]等作用。前期研究發(fā)現(xiàn)山楂酸對(duì)順鉑所致的大鼠腎毒性具有保護(hù)作用，且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明山楂酸對(duì)順鉑所致的細(xì)胞毒性有保護(hù)作用。因此，本研究選用人腎小管上皮細(xì)胞，研究山楂酸對(duì)順鉑所致氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

山楂酸(長(zhǎng)沙雅瑩生物科技有限公司)，順鉑(南京建成生物工程研究所)，維生素E(中國(guó)食品藥品檢定研究院)，人近段腎小管上皮細(xì)胞HK-2(由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫(kù)提供)；GSH試劑盒、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，DMEM干粉培養(yǎng)基(美國(guó) Invitrogen 公司)，DCFH.DA-ROS檢測(cè)試劑盒(杭州碧云天公司)；胎牛血清 (Hyclone)，其它試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)5×104/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24h 后，換無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12h。采用“MTT 檢測(cè)細(xì)胞存活率”處理，離心 (1000r·min-1，5min)收集上清液中的漂浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化收集。各組細(xì)胞用4℃預(yù)冷的PBS離心洗滌2次，加生理鹽水300μL進(jìn)行超聲破碎，離心收集上清液。按照GSH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，取上清液250μL進(jìn)行去蛋白處理，離心后取上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液加入到 96 孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)405nm處的吸收度并計(jì)算 GSH 含量。同樣收集上清液，用MDA試劑盒檢測(cè)MDA含量活性。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)活性氧( ROS)含量檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)1×104/mL (200μL/孔) 接種于96孔黑色接種板，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，更換5%血清培養(yǎng)基，加入山楂酸或維生素E預(yù)孵育2h，除盡培養(yǎng)基；參照碧云天公司的活性氧檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，裝載DCFH-DA探針，37℃培養(yǎng)箱孵育20 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，再加入順鉑(30μmol·L-1)孵育2h，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm、發(fā)射波長(zhǎng)525nm。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡和壞死 細(xì)胞以5×105cells/mL密度種板于6孔板，24h后棄除培養(yǎng)基，換無(wú)血清培養(yǎng)基，12h后棄除無(wú)血清培養(yǎng)基，換新的無(wú)血清培養(yǎng)基，相應(yīng)組給予2-DG、Nec-1或z-VAD-fmk，30min給予CsA，繼續(xù)培養(yǎng)24h，結(jié)束培養(yǎng)時(shí)用不含EDTA的消化液消化細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 山楂酸對(duì)順鉑所致細(xì)胞內(nèi)GSH減少的影響

給予順鉑作用12h，細(xì)胞內(nèi)GSH減少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；先給予山楂酸、維生素E，再給予順鉑，細(xì)胞內(nèi)GSH相對(duì)于單獨(dú)CsA組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 山楂酸對(duì)順鉑所致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)減少的影響

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05；與順鉑組比較，#P<0.05。

2.2 山楂酸對(duì)順鉑所致細(xì)胞內(nèi)MDA的影響

給予順鉑作用12h，細(xì)胞內(nèi)MDA增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；預(yù)先給予山楂酸、維生素E，再給予CsA，細(xì)胞內(nèi)MDA相對(duì)于單獨(dú)CsA組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 山楂酸對(duì)順鉑所致細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，#P<0.05。

2.3 山楂酸對(duì)順鉑所致細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

CsA作用12h，引起細(xì)胞內(nèi)ROS急劇增加，山楂酸能夠抑制CsA所致ROS增加；維生素E作為ROS清除劑，能降低CsA作用后細(xì)胞內(nèi)ROS含量，山楂酸作用接近維生素E。見圖3。

圖3 山楂酸對(duì)順鉑所致細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，#P<0.05。

2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡和壞死結(jié)果

順鉑能引起細(xì)胞凋亡以及壞死，而山楂酸與維生素E均能減少順鉑所致的細(xì)胞凋亡和壞死，且山楂酸作用與維生素E作用相當(dāng)。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)法測(cè)定山楂酸對(duì)順鉑所致腎小管上皮細(xì)胞凋亡和壞死的影響

3 討論

腎臟作為順鉑在體內(nèi)的主要排泄器官，且腎臟也是順鉑的主要毒性靶器官，其腎毒性極大限制了順鉑的臨床應(yīng)用[10]。有文獻(xiàn)[11-13]報(bào)道，順鉑誘發(fā)的腎毒性與氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧化損傷密切相關(guān)。順鉑可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量氧化自由基基，同時(shí)還可抑制細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶(GSH、MOD、GST等)系統(tǒng)。據(jù)研究[14-15]表明，一些天然抗氧化成分能在一定程度上減輕順鉑的細(xì)胞毒性。

山楂酸為植物提取的天然成分，MONTILLA等[16]發(fā)現(xiàn)山楂酸能抑制由氧自由基引起的肝細(xì)胞膜中脂質(zhì)過(guò)氧化。因此，山楂酸可用于抵抗生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激作用，避免細(xì)胞受到損傷。

前期研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討山楂酸對(duì)順鉑所致大鼠腎毒性的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，山楂酸對(duì)順鉑的腎毒性具有保護(hù)作用[17]。因此，本研究運(yùn)用人近段腎小管上皮細(xì)胞為模型細(xì)胞，研究山楂酸對(duì)順鉑誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制。本研究選擇HK-2細(xì)胞作為體外氧化損傷細(xì)胞模型，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶GSH含量及體內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平，同時(shí)運(yùn)用DCFH-DA探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示山楂酸可確切降低順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平，增加抗氧化酶GSH含量。采用流式細(xì)胞術(shù)再次研究山楂酸對(duì)順鉑所致細(xì)胞凋亡及壞死的保護(hù)作用，結(jié)果顯示山楂酸對(duì)順鉑所致的細(xì)胞毒性有保護(hù)作用。

綜上所述，山楂酸可減輕順鉑氧化應(yīng)激損傷，但其具體保護(hù)機(jī)制如所涉及的信號(hào)通路等有待進(jìn)一步研究。

[1] HAN X, YUE J, CHESNEY RW. Functional TauT protects against acute kidney injury[J]. J Am Soc Nephrol, 2009, 20: 1323-1332.

[2] CHIRINO YI,PEDRAZA-CHAVERRI J.Role of oxidative and nitrosative stress in cisplatin-induced nephrotoxicity [J].Exp Toxicol Pathol, 2009, 61: 223-242.

[3] YAO JW, LIU J, KONG XZ, et al.Induction of activation of the antioxidant response element and stabilization of Nrf2 by 3-(3- pyridylmethylidene)-2-indolinone (PMID) confers protection against oxidative stress-induced cell death[J].Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 259: 227-235.

[4] NUMATA A, YANG P, TAKAHASHI C, et al. Cytotoxic triterpenes from a Chinese medicine, goreishi[J]. Chemical & pharmaceutical bulletin, 1989, 37(3): 648-651

[5] AGIL A, FULLER C J, JIALAL I. Susceptibility of plasma to ferrous iron/hydrogen peroxide-mediated oxidation: demonstration of a possible fenton reaction[J].Clinical Chemistry, 1995, 41(2): 220-225.

[6] FINKEL T, HOLBROOK NJ. Oxidants, oxidative stress andthe biology of ageing. Nature，2000,408(6809):239-247

[7] XU H X, ZENG F Q, WAN M, et al. Anti-HIV triterpene acids from Geum japonicum[J]. Journal of natural products, 1996, 59(7): 643-645.

[8] BRACA A, MORELLI I, MENDEZ J, et al. Antimicrobial triterpenoids from Licania heteromorpha[J]. Planta medica, 2000, 66(08): 768-769.

[9] LIU J, SUN H, DUAN W, et al, Maslinic acid reduces blood glucose in KK-Ay mice [J]. Biol Pharm Bull, 2007, 30(11): 2075-2078.

[10] ARANY I, SAFIRSTEIN RL.Cisplatin nephrotoxicity[J].Semin Nephrol 2003,23(5):460-464.

[11] KAWAAI Y, NAKAO T, KUNIMURA N, et al. Relationship of intracellular calcium and oxygen radicals to Cisplatin-related renal cell injury[J]. J Pharmacol Sci ,2006,100(1):65-72.

[12] ZHOU H, KATO A, MIYAJI T, et al.Urinary marker for oxidative stress in kidneys in cisplatin-induced acute renal failure in rats [J].Nephrol Dial Transplant, 2006, 21: 616-623.

[13] RYU HG，JEONG SJ，KWON HY, et al.Penta-O-galloyl-β-D-glucose attenuates cisplatin-induced nephrotoxicity via reactive oxygen species reduction in renal epithelial cells and enhances antitumor activity in Caki-2 renal cancer cells [J].Toxicol In Vitro, 2012, 26: 206-214.

[14] 劉曉華,黎七雄.川芎嗪對(duì)順鉑腎損傷大鼠腎細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2005,19(5):352-356.

[15] 張英,黃維義,王順蓉，等.姜黃素抗順鉑腎毒性作用及其機(jī)制研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2007,18(7):1673-1975.

[16] MONTILLA MP,AGIL A,NAVARRO MC,et al.Antioxidant activity of maslinic acid, a triterpene derivative obtained from Olea europaea[J].Planta Med, 2003, 69(5): 472-474.

[17] 歐陽(yáng)資章,朱少華,鄔淑紅,等.山楂酸對(duì)順鉑所致大鼠腎毒性的保護(hù)作用[J].中國(guó)新藥與臨床雜志, 2013, 32(9): 727-730.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

2014-08-13

歐陽(yáng)資章(1973-)，男,博士，廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院副主任藥師，研究方向?yàn)樗幬锒纠韺W(xué)。

R285

A

1673-2197(2014)24-0009-03