張志琴，宿軼冬，劉光明，郭向群

(1.楚雄醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校 藥學(xué)系，云南 楚雄 675005；2.楚雄技師學(xué)院，云南 楚雄 675000；3.大理學(xué)院 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000)

?

HPLC法同時(shí)測(cè)定松塔中槲皮素和山奈酚含量

張志琴1，宿軼冬2，劉光明3，郭向群1

(1.楚雄醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校 藥學(xué)系，云南 楚雄 675005；2.楚雄技師學(xué)院，云南 楚雄 675000；3.大理學(xué)院 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000)

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定松塔藥材中兩種有效成分槲皮素和山奈酚的含量測(cè)定方法。方法：色譜柱為InertSustain C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1% 磷酸(B)，梯度洗脫；流速為1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。結(jié)果：松塔中槲皮素在0.034～0.272μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)(r = 0. 999 9)，山奈酚在0. 039～0. 317μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)(r=0.999 8)與各自峰面積積分呈良好的線性關(guān)系，槲皮素平均回收率為99.74%(RSD=1.92%)，山奈酚為98.33%(RSD=1.36%)。結(jié)論：該法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為評(píng)價(jià)松塔藥材質(zhì)量的依據(jù)。

松塔；槲皮素；山奈酚；HPLC

松科松屬植物在全世界范圍內(nèi)約有80余種，分布于北半球，可直達(dá)北極圈，在熱帶和亞熱帶地區(qū)只生長(zhǎng)于山地。我國(guó)有22種，10個(gè)變種，另引進(jìn)16種，2個(gè)變種，合計(jì)50余種，分布廣泛[1]。松塔系松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物的球果，別名松球、松實(shí)、松元，曾收載于《中國(guó)藥典》1977年版一部[2]，具有祛痰、止咳、平喘的功效。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從松屬植物中分離到的化學(xué)成分主要有萜類(lèi)、黃酮、木質(zhì)素、多糖等[3-4]，具有抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等生物活性[5-7]，具有重要的藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該植物資源，本文對(duì)采自云南的三種松塔中的槲皮素和山奈酚含量進(jìn)行測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀LC-20A(日本島津)，二級(jí)管陣列檢測(cè)器SPD-M20A(日本島津)，自動(dòng)進(jìn)樣器SPD-M20A(日本島津)。SartoriusAGBS110S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 試藥

槲皮素對(duì)照品(批號(hào)為100081-200907，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；山奈酚對(duì)照品(批號(hào)為110861-200808，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。松塔藥材采自云南省大理州和怒江州，經(jīng)大理學(xué)院生藥教研室周濃鑒定為云南松(PinusyunnanensisFranch)、華山松(PinusarmandiiFranch)和喬松(PinuswallichianaA. B. Jackson)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱: InertSustainC18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0min：15%A；15min：40%A；25min：20%A) ；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；流速：1.0mL /min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 對(duì)照品制備

分別取槲皮素和山奈素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加無(wú)水甲醇制成每毫升分別含槲皮素0.170mg和山奈酚0.198mg的混合溶液作為貯備液。精密吸取貯備液1mL，稀釋至10mL，即得。

2.3 供試品溶液制備

取65目松塔粉末約0.5g，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇-25%鹽酸(4∶1)混合溶液50mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流1h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、10、12、16μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定槲皮素與山奈酚峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程分別為Y =6×106X-131.2，r=0.999 9和Y=4×106X-777.6，r=0.999 8。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，槲皮素在0.034～0.272μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)，山奈酚在0.039～0.317μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)與各自峰面積積分呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次，分析槲皮素和山奈素峰面積積分值，其RSD分別為1.54%和0.92%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

平行操作制備供試品溶液6份，吸取供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。槲皮素和山奈酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD分別為1.38%和1.03%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24h吸取供試品溶液10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并記錄峰面積。槲皮素和山奈酚峰面積RSD分別為1.05%和1.12%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知槲皮素與山奈酚含量的松塔粉末0.5g，精密稱(chēng)定，共稱(chēng)取6份，每份分別加入一定量的槲皮苷與槲皮素對(duì)照品，按供試品制備方法制成供試品溶液，并按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素平均回收率為99.74%(n=6)，RSD=1.92%，山奈酚平均回收率為98.33%(n=6)，RSD=1.33%，表明該測(cè)定方法結(jié)果準(zhǔn)確。回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 槲皮素和山奈酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

分別取采自云南大理地區(qū)和怒江地區(qū)的6批樣品，按照供試品溶液制備方法操作，然后按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定供試品中槲皮素和山萘素的含量，對(duì)照品和供試品色譜見(jiàn)圖1，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 對(duì)照品溶液(A)和樣品溶液(B)HPLC色譜

注：1.槲皮素；2.山奈酚

表2 云南產(chǎn)幾種松塔中槲皮素和山奈酚含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

3 討論

(1)檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)槲皮素、山奈酚素對(duì)照品混合溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明槲皮素對(duì)照品溶液在372nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，山奈酚對(duì)照品溶液在368nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，結(jié)合3D圖譜，兼顧二者選擇360nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

(2)提取溶劑選擇：本實(shí)驗(yàn)共考察了甲醇-鹽酸(4∶1)、甲醇-25%鹽酸(4∶1) 、甲醇-2mol/L硫酸(4∶1)、甲醇-硫酸(4∶1)四種提取溶劑，結(jié)果表明采用甲醇-25%鹽酸( 4∶1)作為提取溶劑時(shí)提取效果最優(yōu)。

(3)流動(dòng)相系統(tǒng)選擇：本實(shí)驗(yàn)共考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸等度和梯度洗脫，結(jié)果表明采用乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫時(shí)分離效果較好。

綜上所述，本研究建立的同時(shí)測(cè)定松塔中槲皮素與山奈酚含量方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性良好，對(duì)云南產(chǎn)幾種松塔藥材的質(zhì)量控制有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步制定松塔藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].第7卷.北京:科學(xué)出版社,1978:524.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].第1部. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1977:334.

[3] 楊鑫,丁怡,孫志浩,等.松塔化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2005,40(5):435-437．

[4] FANG M,LANG C I,CHEN W L,et al. Diterpenoid acids from the leaves of armand pine [J].Phytochemistry,1991,30(8):2793-2795.

[5] 呂永俊,王士賢,彭芳,等.松果有效成分研究—Ⅵ紅松與油松松塔及松子殼的抗癌活性[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào),2008,7(2):1-2.

[6] WATANABE K, MOMOSE F,HANDA H,et al.Interaction between influenza virus proteins and pine cone substance that inhibits the virus multiplication[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1995,214(2):318-323．

[7] UNTEN S,SAKAGAMI H,KONNO K.Stimulation of granulocytic cell iodination by pine cone antitumor substances[J].Journal of Leukocyte Biology,1989,45(2): 168-375.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Simultaneous Determination of Quercetin and Kaempferol in Pinecone by HPLC

Zhang Zhiqin1, Su Yidong2, Liu Guangming3, Guo Xiangqun1

(1. Pharmacy Department , Chuxiong Medical College, Chuxiong 675005,China; 2.Chuxiong Technology College , Chuxiong 675000,China; 3. College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali 671000,China)

Objective:To establish an analytical method on simultaneous determination of queretin and kaempferol in Pinecone.Methods:The sample was determined on InertSustain C18column ( 250mm×4.6mm, 5μm ) . The mobile phase was A (Acetonitrile) -B ( 0.1% phosphoric acid solution ) with gradient elution and the flow rate was 1.0mL/min, the UV detector was set at 360nm.Results:A linear relationship of quercetin was good at the range of 0. 034～0.272μg ( r = 0. 999 9) and kaempferol was good at the range of 0.039～0.317μg ( r=0. 999 8). The average recovery of quercetin was 99.74% (RSD=1.92%) and of kaempferol was 98.33% (RSD=1.36%). Conclusion:The method is accurate, reliable and repeatable with stable result. It can be used as a method of quantitative determination of quercetin and kaempferol in the Pinecone.

Pinecone; Quercetin; Kaempferol; HPLC

2014-07-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260632)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2012Y328)

張志琴(1979-)，女，白族，楚雄醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校副教授，研究方向?yàn)橹兴幉募捌渲苿┵|(zhì)量控制。 E-mail: cxyzzzq@163.com

R284.1

A

1673-2197(2014)22-0014-02