張伏軍 ，須 建 ，尹小玲

（1.重慶三峽中心醫(yī)院藥劑科，重慶 404000；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 401331）

益陰消渴滴丸由葛根、苦瓜、山藥、荔枝核等4味藥材組方的中藥復(fù)方制劑，具有益氣養(yǎng)陰、清熱生津功效，臨床用于氣陰不足所致消渴，以及2型糖尿病見(jiàn)上述證候者，療效顯著。為有效控制該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)制劑中的葛根、荔枝核進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定葛根中有效成分葛根素的含量，所得定性、定量分析方法可客觀反映制劑的內(nèi)在品質(zhì)，為該品種的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)指標(biāo)提供了理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；薄層成像色譜儀（瑞士卡瑪公司）；AE-240S型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）；KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；硅膠G預(yù)制薄層板（青島海洋化工有限公司）。葛根素對(duì)照品（批號(hào)為752-200108，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；益陰消渴滴丸樣品，缺葛根、缺荔枝核陰性樣品（本院提供）；甲醇（色譜純，廠家）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別（TLC法）

葛根:取本品3丸，加甲醇15mL，超聲10min，濾過(guò)，濾液濃縮至約5 mL，作為供試品溶液。另取葛根素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺葛根陰性樣品3丸，同法制成缺葛根陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2010年版《中國(guó)藥典（一部）》（附錄ⅥB）]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 H薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm處）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾（見(jiàn)圖1A）。

荔枝核:取本品15丸，加水50 mL，超聲溶解，用乙醚振搖提取3次，每次 30 mL，水溶液揮去乙醚，用水飽和正丁醇提取3次，每次25 mL，合并水飽和正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另稱取荔枝核藥材粉末1.0 g，加甲醇 25 mL，超聲 30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至約1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。再取缺荔枝核陰性樣品15丸，同法制成缺荔枝核陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2010年版《中國(guó)藥典（一部）附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取供試品溶液、缺荔枝核陰性對(duì)照品溶液各10μL及對(duì)照藥材溶液6μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（9 ∶1 ∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾（見(jiàn)圖1B）。

圖1 薄層色譜圖

2.2 葛根素含量測(cè)定（HPLC法）

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:迪馬 C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相:甲醇 - 水（25 ∶75）；流速:1.0 mL /min；檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm；柱溫:30℃。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

取樣品10丸，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率 100W，頻率 40 kHz）10 min，放冷，用甲醇溶解，定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；精密稱取干燥至恒重的葛根素對(duì)照品8.84 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.088 4 g/L葛根素對(duì)照品溶液；取不含葛根的陰性樣品適量，照供試品溶液制備方法，得缺葛根陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn):精密吸取 2.2.2項(xiàng)下 3種溶液各 10μL，依法進(jìn)樣測(cè)定。供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，陰性對(duì)照品色譜中則無(wú)此色譜峰。結(jié)果表明陰性對(duì)照不干擾樣品測(cè)定，目標(biāo)峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5。見(jiàn)圖 2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品溶液 2，4，8，12，16，20 μL，注入液相色譜儀。以峰面積積分值 A為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A＝7 011 291C-37 635.5，r＝0.999 9（n＝6）。結(jié)果表明，葛根素進(jìn)樣量在 0.173 8 ～1.738 0 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次（進(jìn)樣量10μL），測(cè)定峰面積。結(jié)果葛根素峰面積 RSD為 0.44%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份供試品溶液，分別于制備后0，1，4，10，14 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果葛根素峰面積 RSD 為 0.37%（n＝5），表明供試品溶液至少在14 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品，按擬訂的含量測(cè)定方法，分別制備5份供試品溶液，測(cè)定葛根素含量。結(jié)果的 RSD為 1.14%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

表1 葛根素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品內(nèi)容物適量，研細(xì)，精密稱定6份，分別加入葛根素對(duì)照品溶液適量（配成溶液加入），按擬訂的含量測(cè)定方法測(cè)定葛根素含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)的樣品，按供試品制備方法處理后依法測(cè)定，計(jì)算葛根素的含量。結(jié)果批號(hào)為130401，130402，130403的樣品中葛根素含量分別為 24.96，24.86，24.75mg /g。

3 討論

對(duì)本制劑中葛根、荔枝核的薄層鑒別研究，分別以對(duì)照藥品、對(duì)照藥材為對(duì)照，經(jīng)方法學(xué)考察，薄層色譜斑點(diǎn)分離良好，斑點(diǎn)圓整清晰，陰性無(wú)干擾，同時(shí)試驗(yàn)3批成品，結(jié)果均能檢出相應(yīng)色譜斑點(diǎn)，表明選定的方法具有專屬性和重現(xiàn)性，可作為益陰消渴滴丸制劑質(zhì)量控制的定性檢測(cè)方法。

用甲醇制備葛根素對(duì)照品溶液，進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果在250 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。參考2010年版《中國(guó)藥典（一部）》葛根藥材含量測(cè)定項(xiàng)下方法，本試驗(yàn)選用250 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。在此條件下，色譜圖基線平穩(wěn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

取益陰消渴滴丸40丸，研細(xì)成粉末，混勻，精密稱定3份，置25mL錐形瓶中，分別加甲醇、30%乙醇、70%乙醇各20mL，超聲處理10 min，取出，冷卻，轉(zhuǎn)移置25 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解、30% 乙醇、70% 乙醇定容，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定葛根素含量。結(jié)果表明，以甲醇提取效果更好，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

本試驗(yàn)中建立的鑒別葛根、荔枝核的TLC法，能鑒別出葛根、荔枝核的特征性斑點(diǎn)；建立的測(cè)定葛根素含量的HPLC法，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性符合要求。上述兩種方法為制訂益陰消渴滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

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