曾清華 ，饒 慧 ，高潔生

(1．湖南省人民醫(yī)院腎內(nèi)風濕免疫科，湖南 長沙 410006;2．中南大學湘雅二醫(yī)院風濕免疫科，湖南 長沙 410000)

3，5，4’-三甲氧基二苯乙烯(3，5，4'-trimethoxystilbene，BTM)是以白藜蘆醇為原料人工合成的一種新型甲基化衍生物。白藜蘆醇是一種具有多種生物學活性的非黃酮類多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、防治心血管疾病及抗衰老等作用。近年來其抗炎作用越來越多地受到重視，然而由于分子中有3個酚羥基，白藜蘆醇很不穩(wěn)定，極易被氧化，而且血中半衰期短，生物利用度有限，因此限制了其臨床使用效果[1]。BTM的穩(wěn)定性和生物活性較白藜蘆醇均大大增強[2]，但目前對BTM的研究都主要集中在抗腫瘤方面，關于其對炎癥細胞產(chǎn)生炎癥因子的影響，國內(nèi)外文獻報道極少。本試驗擬以小鼠巨噬細胞作為BTM作用的靶點，觀察BTM對小鼠巨噬細胞經(jīng)脂多糖(LPS)誘導后產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及細胞核因子-κB(NF-κB)活性的影響，探討其抗炎作用?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、材料與方法

1．1 儀器與材料

超凈工作臺(ThermoForma MSC)，培養(yǎng)箱(Thermo Forma3111)，倒置顯微鏡(Nikon TMS-F)，光學顯微鏡(Olympus BX50)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Labsystems Dragon Wellscan MK2)等。RAW264．7 小鼠巨噬細胞，L929小鼠成纖維細胞。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0．25%胰酶(均購于美國Gibco公司);結晶紫、放線菌素D、LPS(均購于美國Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO)，十二烷基磺酸納(SDS)(均購于美國Amresco公司);兔抗鼠NF-κB多克隆抗體、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(均購于武漢博士德公司);白藜蘆醇、BTM由中南大學化工學院合成提供。

1．1 試驗方法

1．2．1 對巨噬細胞RAW264．7的處理

調(diào)整 RAW246．7密度為3×105/mL，接種于24孔板，每孔1 mL，同時放入無菌蓋玻片，培養(yǎng)24 h后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗 2 遍，加入濃度分別為 5，10，20，40，80 μmol/L 的 BTM 和白藜蘆醇 1 mL/孔培養(yǎng) 30 min，再加入 10 μg/mL的 LPS 1 mL/孔培養(yǎng)6 h，收集細胞上清液，檢測TNF-α的活性，以細胞爬片檢測巨噬細胞中NF-κB的表達。以加白藜蘆醇的細胞作為藥物對照組，以不加藥物僅加LPS的細胞作為陰性對照組(LPS組)，以不加藥物亦不加LPS的細胞作為正常對照組。

1．2．2 L929細胞結晶紫染色法檢測TNF-α的活性

調(diào)整L929細胞密度為3×105/mL，接種于96孔板，每孔加入100 μL，再加入2 μg/mL的放線菌素D每孔100 μL及各組培養(yǎng)上清液每孔100 μL，以RPMI-1640為對照組，24 h后棄去上清液，加入0．5%的結晶紫200 μL染色10 min，用流水洗去結晶紫，常溫干燥，加 10%SDS100 μL，置于 37 ℃，30 min，混勻后在 490 nm 波長處測吸光度(OD)值。用細胞毒百分率表示上清液所含TNF-α的活性，抑制百分率表示藥物對小鼠巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α的抑制程度。細胞毒百分率(%)=(1-上清液 OD值/對照 OD值)×100%，抑制百分率(%)=(1-藥物上清液細胞毒百分率/陰性對照上清液細胞毒百分率)×100%。

1．2．3 BTM和白藜蘆醇對L929細胞的毒性檢測

如上方法，在長滿L929細胞的96孔板內(nèi)加入不同濃度的BTM和白藜蘆醇，檢測藥物本身對L929細胞生長的影響。

1．2．4 免疫細胞化學法檢測NF-κB的活性

按試劑盒說明書進行操作，陰性對照以PBS代替一抗，陰性對照片僅為背景著色，巨噬細胞內(nèi)無棕黃色染色。NF-κB免疫化學染色結果判定:細胞爬片中巨噬細胞胞核呈棕黑色染色或(和)胞核附近的胞漿呈棕黃色染色為陽性細胞。陽性細胞率計算:每張細胞爬片在光鏡下計數(shù)5個400倍視野，根據(jù)視野中陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)比例計算陽性率。陽性細胞率(%)=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1．3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2．1 BTM和白藜蘆醇對L929細胞的毒性檢測

由表1可見，不同濃度BTM和白藜蘆醇組 OD值與RPMI-1640組相比，差異均無統(tǒng)計學意義，各濃度組藥物本身對L929細胞生長無影響，巨噬細胞培養(yǎng)上清液可直接用于測定TNF-α的活性而不需透析。

表1 藥物和L929細胞共同培養(yǎng)后的 OD值

2．2 L929細胞結晶紫染色法檢測TNF-α的活性

由表2可見，隨著藥物濃度的增大，細胞上清液中細胞毒百分率逐漸下降，藥物的抑制百分率逐漸升高，且BTM的作用強于白藜蘆醇，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。

表2 上清液和L929細胞共同培養(yǎng)后的結果

2．3 免疫細胞化學法檢測NF-κB的活性

由表3可見，巨噬細胞經(jīng)白藜蘆醇和BTM處理后各藥物濃度組NF-κB的陽性細胞率與LPS組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)，且BTM的作用強于白藜蘆醇。

2．4 藥物濃度、TNF-α活性及NF-κB活性之間的相關性分析

白藜蘆醇的濃度與巨噬細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的細胞毒百分率及巨噬細胞爬片中NF-κB的陽性細胞率呈負相關，相關系數(shù)分別為 -0．962和-0．964，P值均為0．002;BTM的濃度與巨噬細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的細胞毒百分率及巨噬細胞爬片中NF-κB的陽性細胞率亦呈負相關，相關系數(shù)分別為-0．876 和 -0．881，P 值分別為 0．022 和 0．020;巨噬細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的細胞毒百分率和巨噬細胞爬片中NF-κB的細胞陽性率成正相關，相關系數(shù)為0．997，P值為0．000。

3 討論

巨噬細胞是一種重要的炎性細胞，可產(chǎn)生TNF-α、白細胞介素-1(IL-1)、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等多種前炎性因子。TNF-α作為主要的炎性細胞因子，在局部炎性反應和組織損傷中均居于重要地位，NF-κB介導許多來自巨噬細胞的炎性介質(zhì)的表達，是TNF-α等基因活化的重要轉(zhuǎn)化因子。白藜蘆醇是一種具有多種生物學活性的非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于食用和藥用植物中，是植物為抵抗外來侵害時產(chǎn)生的一種植物抗毒素，目前白藜蘆醇對炎性反應的影響在LPS誘導的巨噬細胞中研究較多。本研究結果顯示，巨噬細胞經(jīng)LPS刺激后被激活，產(chǎn)生大量的TNF-α且NF-κB被顯著活化，而將巨噬細胞與白藜蘆醇共同培養(yǎng)后，LPS刺激的TNF-α的產(chǎn)生和NF-κB的活化都受到不同程度的抑制，顯示白藜蘆醇可以通過抑制NF-κB的活化從而抑制TNF-α的產(chǎn)生，且呈濃度依賴性，隨著藥物濃度的增高抑制作用逐漸增強。

BTM 是到目前為止發(fā)現(xiàn)的活性最強的白藜蘆醇的甲基化衍生物，為白色無定形粉末，可溶于乙醇、甲醇、DMSO，不溶于水。目前對BTM的研究主要集中在抗腫瘤方面。與白藜蘆醇相比，BTM不僅大大提高了生物利用度，而且在保留白藜蘆醇生物藥理特性的基礎上，抑制腫瘤細胞的有絲分裂使細胞周期停滯及抑制微管蛋白聚合的作用都顯著增強，是白藜蘆醇的100倍[3]。Chabert等[4]利用自己合成的BTM，研究其對多種不同癌細胞株的影響，包括人直腸腺癌細胞(Caco-2)、SW-480(人結腸腺癌細胞)、SW-620、SW-480(轉(zhuǎn)移癌細胞)、KB(人頭頸部癌細胞)、TK-6(人淋巴瘤細胞)等，亦得到與本研究類似的結果，且發(fā)現(xiàn)BTM本身對細胞并沒有直接的細胞毒作用。Matsuda等[5]研究認為，BTM苯環(huán)上的甲氧基對于藥物的活性很重要，尤其是3位上的甲氧基，證實了BTM具有抗變應性活性，可顯著抑制抗原誘導的RBL-2H3細胞TNF-α和白細胞介素-4(IL-4)的釋放。Simoni等[6]用順式BTM作用于人前髓細胞性白血病細胞(HL-60)，發(fā)現(xiàn)BTM可影響整個細胞分裂周期，包括G0/G1期、S期及G2/M期，減少各個時期的細胞數(shù)，使凋亡細胞的比例增加。Seiler等[7]研究順式BTM對SW-620的作用發(fā)現(xiàn)，其會導致細胞多倍體化，引起MMP-7及tPA等一些蛋白水解酶分泌的增加，但細胞的侵襲力下降，且侵襲力與藥物濃度成負相關。BTM還具有非常強的抗血管生成作用，其抑制內(nèi)皮細胞增殖、生長、膠原質(zhì)侵入和形態(tài)形成等活性是白黎蘆醇的30～100倍，并具有很強的血管靶向性，可顯著引起內(nèi)皮細胞中的微管分解和微管蛋白解聚[8]。Pan等[9]最近研究顯示，BTM抑制人類腫瘤細胞生長的潛力強于白藜蘆醇，可通過調(diào)控活性氧類(ROS)來調(diào)節(jié)線粒體的功能并誘導細胞凋亡，且ROS在凋亡的早期即已產(chǎn)生，要早于細胞色素C的釋放、caspase的激活及DNA鏈的斷裂;此外，他們還利用攜帶COLO-205腫瘤的重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠進行了體內(nèi)試驗，給小鼠腹腔注射質(zhì)量濃度為50 mg/kg的BTM可見顯著的治療效果，觀察到接受治療的腫瘤部位出現(xiàn)了DNA鏈的斷裂和caspase的激活，表明有細胞凋亡產(chǎn)生，另外還有細胞分裂周期抑制因子p21蛋白表達的增加和增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達的減少。但關于BTM對炎癥細胞產(chǎn)生炎性因子的影響，國內(nèi)外相關文獻報道極少。Deng等[10]的研究提示，BTM可能具有比白藜蘆醇更強的抗炎能力。本研究中，通過觀察BTM對炎性巨噬細胞的影響發(fā)現(xiàn)，BTM和白藜蘆醇一樣，亦可抑制LPS誘導的TNF-α的產(chǎn)生和NF-κB的活化，并呈濃度依賴性，隨著藥物濃度的增高抑制作用逐漸增強。因此推斷，BTM亦可通過抑制NF-κB的活性來減少TNF-α的產(chǎn)生，而且BTM的抑制作用比白藜蘆醇更強。

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