李景源 吳劉成 鄭波 邵義祥

作者單位：226001 南通 江蘇南通大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所

基礎(chǔ)研究

雷公藤紅素對(duì)裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制作用的研究

李景源 吳劉成 鄭波 邵義祥

作者單位：226001 南通 江蘇南通大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所

目的 研究天然活性化合物雷公藤紅素（celastrol）對(duì)裸鼠移植腫瘤的抑制作用。方法建立人源肝癌HepG2細(xì)胞的裸鼠皮下移植腫瘤模型。20只裸鼠隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組和雷公藤紅素高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組分別按4.0 mg/kg、2.0 mg/kg、1.0 mg/kg雷公藤紅素腹腔給藥，每日一次，每周5 d，共給藥30 d，實(shí)驗(yàn)中每5 d測(cè)量一次腫瘤體積的變化。結(jié)果 雷公藤紅素高劑量組、中劑量組和低劑量組的體積抑瘤率分別是89.52%、65.60%和12.21%，與空白對(duì)照組相比，高劑量組、中劑量組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高劑量雷公藤紅素給藥后對(duì)裸鼠肝臟和腎臟等產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性反應(yīng)。結(jié)論 雷公藤紅素對(duì)裸鼠肝癌皮下移植瘤具有良好的體內(nèi)抗腫瘤效果，應(yīng)進(jìn)一步開展藥物新劑型及分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化方面的研究，減少其毒副反應(yīng)。

肝腫瘤；雷公藤紅素；肝癌皮下移植瘤模型；抑制；毒性

雷公藤紅素（celastrol），別名南蛇藤素，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤tripterygium wilfordii Hook.f.的根、葉及花中提取的、具有多種生物活性的活性單體之一，屬醌甲基三萜類色素，因其具有確切的抗炎、免疫抑制及抗癌作用而受到越來越廣泛關(guān)注［1，2］。中美科學(xué)家合作研究表明，雷公藤紅素作為一種蛋白酶體抑制劑具有出色的抗腫瘤效果，抑瘤率高達(dá)65%～93%，遠(yuǎn)高于目前國(guó)際市場(chǎng)上暢銷的紫杉醇注射液［3］。研究表明，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能是雷公藤紅素抗腫瘤作用的主要機(jī)制。我們的前期體外實(shí)驗(yàn)研究也表明，雷公藤紅素具有顯著的抗腫瘤活性，對(duì)白血?。↘562）細(xì)胞、肺癌（A549）細(xì)胞以及肝癌（HepG2）細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用［4，5］。為了進(jìn)一步研究雷公藤紅素在體內(nèi)的抗腫瘤活性，本研究將人源肝癌HepG2細(xì)胞移植于裸鼠皮下，建立裸鼠肝癌皮下移植腫瘤動(dòng)物模型，探討雷公藤紅素的體內(nèi)抗腫瘤活性，以及對(duì)部分正常器官、組織的毒副反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

DMEM高糖培養(yǎng)基（GIBCO，USA）；小牛血清（杭州四季青生物工程公司）；胰蛋白酶（Amresco，USA）；雙抗（Amresco，USA）；雷公藤紅素（廣州牌牌生物科技有限公司）；蘇木素染色液和伊紅染色液（海門市碧云天生物技術(shù)研究所）；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用BALB/c-nu裸小鼠，雌性，體重為22~24 g，鼠齡5~7周，SPF級(jí)，共30只。由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2008-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2012-0031。飼料、飲水和籠具等均經(jīng)高壓滅菌和紫外線消毒后使用。飼養(yǎng)級(jí)別為SPF級(jí)屏障環(huán)境。

1.3 HepG2肝癌細(xì)胞的體外培養(yǎng)

HepG2肝癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.4 BALB/c-nu裸小鼠腫瘤動(dòng)物模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，去上清液，離心洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)并配制約為3×107/ml的細(xì)胞懸液。取上述細(xì)胞懸液0.3 ml，用1 ml注射器將細(xì)胞接種到裸小鼠右腋下皮下組織。接種后正常飼養(yǎng)，觀察裸鼠的生長(zhǎng)情況，待皮下生長(zhǎng)出可觸及的、直徑為3 mm左右的瘤塊時(shí)，剔除瘤塊直徑最大和最小的裸鼠，建立裸鼠皮下移植瘤模型。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

采用隨機(jī)分組的方法，將經(jīng)過篩選的20只荷瘤裸小鼠分成4組，每組5只。即空白對(duì)照組；高劑量組，雷公藤紅素4.0 mg/kg；中劑量組，雷公藤紅素2.0 mg/kg；低劑量組，雷公藤紅素1.0 mg/kg。分組后開始給藥，雷公藤紅素用DMSO助溶后再以PBS稀釋至所需濃度，采用腹腔內(nèi)注射給藥方法分組給藥，每日一次，每周5 d，共給藥30 d。給藥后裸鼠正常飼養(yǎng)。

1.6 荷瘤裸鼠生長(zhǎng)情況的觀察和測(cè)量腫瘤大小

定期觀察荷瘤裸鼠精神、飲食和排便狀況。以開始投藥前所測(cè)腫瘤體積為基準(zhǔn)，每隔5 d測(cè)量荷瘤裸鼠體重，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑和最短徑，共6次。腫瘤體積的計(jì)算公式：V=長(zhǎng)徑×短徑×短徑/2，計(jì)算其平均值并繪制腫瘤體積生長(zhǎng)和體重變化圖。

1.7 腫瘤標(biāo)本的組織學(xué)處理

將荷瘤裸鼠于給藥后第31天脫臼處死。觀察移植瘤的形態(tài)，并取出腫瘤，稱重，置于4%多聚甲醛中固定，逐級(jí)脫水后，制成4 μm石蠟切片，經(jīng)過HE染色后中性樹脂封片，晾干后于倒置顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料用（±s）表示，多組間樣本均數(shù)的比較采用具有重復(fù)測(cè)量的兩因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤裸鼠及腫瘤的生長(zhǎng)狀況

在給藥之前，荷瘤裸鼠的體重隨時(shí)間呈緩慢增加的趨勢(shì)，腫瘤體積也逐漸增大，生長(zhǎng)速率略有差別。腫瘤形態(tài)呈球形或不規(guī)則團(tuán)塊狀，邊界較清楚，有活動(dòng)性，有部分輕微浸潤(rùn)皮膚，說明裸鼠的皮下移植腫瘤模型建模成功。給藥初期，荷瘤裸鼠活動(dòng)正常。給藥10 d后，中劑量組和高劑量組的藥物開始對(duì)荷瘤裸鼠產(chǎn)生一定的毒副反應(yīng)，體重減輕。至實(shí)驗(yàn)接近結(jié)束時(shí)，中劑量組和高劑量組藥物的毒副反應(yīng)明顯，荷瘤裸鼠的行動(dòng)遲緩、厭食，體重明顯減輕。

2.2 腫瘤體積的生長(zhǎng)變化與比較

在對(duì)荷瘤裸鼠給藥后，每隔5 d用游標(biāo)卡尺記錄各組荷瘤裸鼠腫瘤的體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，雷公藤紅素高劑量組、中劑量組和低劑量組的體積抑瘤率分別是89.52%、65.60%和12.21%。如圖1所示，隨著雷公藤紅素劑量的增加，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制率也隨之變大，存在劑量依賴性關(guān)系。采用具有重復(fù)測(cè)量的兩因素方差分析對(duì)多組樣本均數(shù)進(jìn)行比較，F(xiàn)=5.90，P=0.0055，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組4個(gè)組中的腫瘤體積的總體均數(shù)不全相同；進(jìn)一步用最小顯著差法（LSD-t）對(duì)組間兩兩進(jìn)行比較，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而中劑量組和高劑量組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。見表1。

2.3 荷瘤裸鼠體重的變化情況及比較

實(shí)驗(yàn)初期，各組荷瘤裸鼠生長(zhǎng)狀況良好。如圖2所示，對(duì)于空白組和低劑量組的荷瘤裸鼠，實(shí)驗(yàn)過程中未觀察到明顯的毒副反應(yīng)。而對(duì)于高劑量組藥物干預(yù)的荷瘤裸鼠，在實(shí)驗(yàn)的后期，荷瘤裸鼠的體重明顯減輕。采用具有重復(fù)測(cè)量的兩因素方差分析對(duì)多組樣本均數(shù)進(jìn)行比較，F(xiàn)=5.71，P=0.0063，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表示空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組4個(gè)組中的荷瘤裸鼠體重的總體均數(shù)不全相同；進(jìn)一步用最小顯著差法（LSD-t）對(duì)組間進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組荷瘤裸鼠相比，高劑量組荷瘤裸鼠體重的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而中劑量組和低劑量組荷瘤裸鼠體重的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。提示高濃度雷公藤紅素對(duì)荷瘤裸鼠的正常生長(zhǎng)有較大影響，具有較大的毒副反應(yīng)。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠腫瘤體積變化情況

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠體重變化情況

表1 不同實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠腫瘤體積變化的比較（±s，mm3）

表1 不同實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠腫瘤體積變化的比較（±s，mm3）

分別與空白對(duì)照組比較，△P＞0.05;*P＜0.05。

組別 給藥前 第5天 第10天 第15天 第20天 第25天 第30天 F P空白對(duì)照組 16.49±18.07 56.51±20.04 133.12±32.66 224.18±32.41 332.50±45.50 523.40±14.06 836.74±40.05 - -低劑量組 15.23±21.26 48.23±13.77 78.63±25.35 113.34±12.13 194.40±38.71 440.90±57.02 734.53±62.04 1.06 0.318△中劑量組 14.75±20.42 28.13±19.01 52.59±24.12 76.08±33.23 100.72±23.58 164.67±45.58 287.85±43.64 8.34 0.010*高劑量組 13.94±15.36 19.43±10.17 24.06±11.63 32.01±20.05 50.66±16.18 69.00±20.85 87.67±26.37 3.77 ＜0.001*

表2 不同實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠體重變化的比較（±s，g）

表2 不同實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠體重變化的比較（±s，g）

分別與空白對(duì)照組比較，△P＞0.05；*P＜0.05。

組別 給藥前 第5天 第10天 第15天 第20天 第25天 第30天 F P空白對(duì)照組 23.00±0.28 23.40±0.56 23.45±1.06 24.05±1.06 23.80±0.42 24.10±1.35 24.45±0.49 - -低劑量組 22.00±0.56 22.45±0.21 22.30±0.28 22.10±0.98 22.65±0.63 22.26±0.73 22.65±0.63 3.98 0.065△中劑量組 23.70±0.56 23.65±0.21 23.35±0.35 22.75±0.07 22.50±0.84 21.50±0.98 19.50±0.56 3.55 0.076△高劑量組 23.80±0.42 23.25±0.35 22.05±0.63 20.50±0.82 19.90±0.70 18.50±0.84 16.75±0.63 4.13 ＜0.001*

2.4 4組荷瘤裸鼠腫瘤的重量比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將4組荷瘤裸鼠取出腫瘤組織，剔除結(jié)締組織后稱重。對(duì)4組荷瘤裸鼠腫瘤重量進(jìn)行比較，顯示空白對(duì)照組荷瘤裸鼠腫瘤最重［（245.95±20.09）mg］，而雷公藤紅素高劑量組的腫瘤重量最輕［（30.50±13.38）mg］。根據(jù)腫瘤重量計(jì)算抑瘤率，高劑量組為87.60%；中劑量組為64.87%，低劑量組為22.77%，與空白對(duì)照組的腫瘤重量比較，中劑量組和高劑量組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），這與上述3個(gè)劑量組體積抑瘤率的結(jié)果基本一致。顯示腫瘤重量的降低與雷公藤紅素的給藥濃度呈明顯的劑量依賴性。

2.5 荷瘤裸鼠腫瘤組織及肝腎組織HE染色檢查結(jié)果

2.5.1 腫瘤組織 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出荷瘤裸鼠腫瘤組織并經(jīng)石蠟切片后用HE染色。如圖3所示，空白對(duì)照組腫瘤組織完整，雷公藤紅素低劑量組、中劑量組、高劑量組的腫瘤組織的損壞程度呈增強(qiáng)趨勢(shì)。特別是中劑量組和高劑量組，腫瘤組織壞死現(xiàn)象嚴(yán)重，出現(xiàn)大片狀壞死，腫瘤細(xì)胞凋亡較多?？梢娎坠偌t素對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性，且其對(duì)腫瘤組織的破壞程度隨給藥劑量的增加而增強(qiáng)。

2.5.2 肝、腎組織 本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了雷公藤紅素對(duì)荷瘤裸鼠肝臟和腎臟產(chǎn)生的影響。如圖4和圖5所示，通過觀察比較可以看出，空白對(duì)照組和低劑量組荷瘤裸鼠的肝、腎組織的細(xì)胞基本沒有損傷，而中劑量組和高劑量組荷瘤裸鼠的肝、腎組織受到一定程度損壞，特別是高劑量組的腎組織出現(xiàn)細(xì)胞損壞的程度較大。由此可見，隨著雷公藤紅素用藥劑量的增加，雷公藤紅素對(duì)荷瘤裸鼠的肝臟和腎臟產(chǎn)生較嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，對(duì)組織器官產(chǎn)生一定的損害。

3 討論

源于傳統(tǒng)中藥的天然活性化合物在癌癥的治療以及新藥研發(fā)中發(fā)揮著越來越重要的作用。雷公藤紅素是我國(guó)首先從雷公藤根中提煉出來的三萜類活性單體，是雷公藤提取物的主要活性成分之一。雷公藤紅素具有顯著的抗癌活性，在治療人類癌癥方面具有巨大的潛力和應(yīng)用前景［6，7］。雷公藤紅素是熱休克蛋白Hsp90信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑［8，9］，且能夠使SHG-44細(xì)胞bax的表達(dá)增加，bcl-2的表達(dá)下降，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［10］。另外，雷公藤紅素能夠促使人急性髓系白血病HL-60細(xì)胞中NF-κB基因表達(dá)的下調(diào)，并且可上調(diào)Fas、FasL基因的表達(dá)［11］。雷公藤紅素能夠經(jīng)由caspase依賴和caspase非依賴兩種途徑來誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞色素c、AIF等線粒體凋亡蛋白從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)［12］。在原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC和人前列腺癌PC-3細(xì)胞［13］、SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞［14］等細(xì)胞中，雷公藤紅素可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），從而抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和入侵等過程。

圖3 荷瘤裸鼠腫瘤組織HE染色檢查的結(jié)果（HE×200）

圖4 荷瘤裸鼠肝組織HE染色檢查的結(jié)果（HE×400）

圖5 荷瘤裸鼠腎組織HE染色檢查的結(jié)果（HE×400）

目前關(guān)于雷公藤紅素的體內(nèi)抗腫瘤活性以及組織毒性等評(píng)價(jià)試驗(yàn)相對(duì)較少。有報(bào)道稱，雷公藤紅素在SHG44膠質(zhì)瘤裸鼠的抑瘤試驗(yàn)中，雷公藤紅素4 mg/kg組和2 mg/kg組的體積抑瘤率分別為35.0%、26.9%［15］。另外，植入人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤紅素可以抑制VEGF受體1和VEGF受體2的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，這可以說明阻斷VEGF受體的表達(dá)是雷公藤紅素抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的主要機(jī)制［16］。有報(bào)道表明，在人源肺癌（95-D）細(xì)胞建立的裸鼠模型實(shí)驗(yàn)中，將雷公藤紅素與伏立諾他（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，當(dāng)單獨(dú)注射雷公藤紅素（0.5 mg/kg）或SAHA（100 mg/kg）時(shí)，抗腫瘤效果不明顯，當(dāng)聯(lián)合注射兩種藥物時(shí)，其體積抑瘤率達(dá)到70.3%，并且小鼠體重未減輕，毒性較?。?7］。

本實(shí)驗(yàn)中，我們將HepG2肝癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下，建立皮下移植肝癌動(dòng)物模型，研究了雷公藤紅素在體內(nèi)的抗腫瘤活性，并初步探討了雷公藤紅素對(duì)部分組織器官的毒性作用。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，雷公藤紅素對(duì)腫瘤組織具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且存在劑量效應(yīng)的依賴性。雷公藤紅素高劑量組、中劑量組和低劑量組的體積抑瘤率分別是89.52%、65.60%和12.21%，與空白對(duì)照組相比，高劑量組、中劑量組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。同時(shí)，通過對(duì)荷瘤裸鼠部分組織器官的組織學(xué)觀察，顯示雷公藤紅素對(duì)荷瘤裸鼠肝臟和腎臟等組織器官存在一定的毒副反應(yīng)，特別是在中劑量、高劑量給藥時(shí)毒副反應(yīng)更為明顯，這將限制其在臨床治療的實(shí)際應(yīng)用，因此如何降低其對(duì)正常組織細(xì)胞的毒副反應(yīng)，仍需進(jìn)一步研究。深入探討對(duì)化合物結(jié)構(gòu)的改造及新劑型的研發(fā)等將是今后研究工作的重要方向。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過裸鼠皮下移植腫瘤模型的體內(nèi)試驗(yàn)，表明雷公藤紅素對(duì)HepG2細(xì)胞的皮下移植腫瘤具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，并呈劑量依賴性。同時(shí)，高劑量給藥時(shí)，雷公藤紅素對(duì)荷瘤裸鼠肝臟和腎臟等正常器官組織有一定的毒副反應(yīng)。深入分析藥物的抗腫瘤效果和對(duì)正常組織的毒性作用，將為雷公藤紅素的藥效學(xué)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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［2014-07-29收稿］［2014-08-20修回］［編輯 阮萃才］

Celastrol-mediated growth inhibition of subcutaneously transplanted hepatocarcinoma in nude mice

LI Jing-yuan，WU Liu-cheng，ZHENG Bo，SHAO Yi-xiang（Institute of Comparative Medicine，Nantong University，Nantong 226001，P.R.China）

SHAO Yi-xiang.E-mail：shaoyx@ntu.edu.cn

Objective To study the potential of celastrol to inhibit growth of transplanted tumors in nude mice.Methods Nude mice（n=20）subcutaneously injected with HepG2 cells were randomly divided into 4 groups and treated by abdominal injection with 0，1.0，2.0 and 4.0 mg/kg once daily five times per week.Tumor size was measured every five days.Results Tumor volume inhibition was 12.21%for 1.0 mg/kg，65.60%for 2.0 mg/kg and 89.52%for 4.0 mg/kg，and tumor volume was significantly smaller in animals treated with 2.0 or 4.0 mg/kg than in control animals.Severe liver and kidney toxicity were observed in animals treated with 4.0 mg/kg. Conclusion Celastrol shows good anticancer activity in this mouse model of liver cancer.Studies are needed to optimize dosing and drug structure to reduce toxicity.

Liver neoplasm；Celastrol；Liver cancer model；Inhibition；Toxicity

R735.7

A

1674-5671（2014）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.03

江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（13KJB310015）；南通市科技計(jì)劃項(xiàng)目（BK2013045）；南通大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（13R30）；南通大學(xué)自然科學(xué)科研基金助項(xiàng)目（13ZY008）

邵義祥。E-mail：shaoyx@ntu.edu.cn