摘要：目的尋找簡單、可靠、經(jīng)濟準(zhǔn)確的檢測巨噬細(xì)胞中Line-1 甲基化水平的實驗方法。方法體外培養(yǎng)單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞，不同濃度Hcy作用后以甲基化特異性PCR檢測Line-1 DNA甲基化水平變化后，分別克隆擴增相應(yīng)的片段，將不同濃度稀釋的甲基化和非甲基化樣品分別加入到熒光PCR體系中，按照熒光PCR體系進行操作，檢測其熒光表達，根據(jù)相應(yīng)的稀釋倍數(shù)與擴增數(shù)做出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果各Hcy濃度組的Line-1 DNA甲基化程度隨Hcy濃度的增高甲基化程度升高，Line-1 DNA甲基化程度與對照組比較，分別上升了1.30、1.52、1.61、2.18倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；分別得到Line-1 DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-4.3448x+51.512；非甲基化標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-2.7406x+36.208。結(jié)論Line-1 DNA甲基化與Hcy介導(dǎo)的動脈粥樣硬化關(guān)系密切，熒光定量PCR法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線是檢測Line-1 DNA甲基化水平的一種方便且準(zhǔn)確的方法。

關(guān)鍵詞：LINE-1；巨噬細(xì)胞；同型半胱氨酸；DNA甲基化；熒光定量PCR

動脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)是心血管疾病重要的基礎(chǔ)性病變，在AS形成過程中，單核細(xì)胞在相關(guān)危險因子的作用下轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞細(xì)胞的形成是AS主要病理特征之一。同型半胱氨酸(Homocysteine， Hcy)是AS的獨立危險因子[1]，同時有報道指出Hcy可以改變巨噬細(xì)胞中保守序列Line-1 DNA甲基化水平從而影響其表達，并由此進一步導(dǎo)致了AS的發(fā)生。目前檢測甲基化水平的方法很多，但大多屬于定性或半定量方法，且在Hcy介導(dǎo)巨噬細(xì)胞致AS中Line-1 DNA甲基化水平變化目前人們關(guān)注較少，檢測方法單一、不準(zhǔn)確。本文旨在通過觀察Hcy對THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞形成中Line-1 DNA甲基化水平的改變，建立一種新型、高效方便且準(zhǔn)確可行的檢測DNA甲基化的新方法。

1資料與方法

1.1一般資料干粉末RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO.BKI公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品)；Hcy、L-多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)、谷氨酰胺、佛波酯(PMA)(Sigma公司)；THP-1單核細(xì)胞株(四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院)、DNA甲基化檢測試劑盒(賽默公司)、DNA提取試劑盒(promage 公司)。

1.2儀器相差顯微鏡(日本Nikon公司產(chǎn)品)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；SZ-97自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；全自動立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安YXQ-LS50A)；微量臺式離心機(Eppendorf)；CO2孵箱(Heraeus， Germany)；Model680全自動酶標(biāo)儀(Bio-rad，America)等。

1.3方法

1.3.1 THP-1單核細(xì)胞的培養(yǎng)、泡沫細(xì)胞形成和鑒定取液氮中凍存的THP-1單核細(xì)胞株，37℃水浴，完全溶解后加適量RPMI-1640培養(yǎng)基，棄上清，加入PMA使其終濃度為500 mol/l，顯微鏡下觀察，證實THP-1細(xì)胞已分化為巨噬細(xì)胞，更換含不同濃度的Hcy RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。

1.3.2 DNA抽提使用promega DNA提取試劑盒，按說明書進行具體操作。

1.3.3 Line-1DNA甲基化水平檢測設(shè)計甲基化和非甲基化上、下游引物。擴增反應(yīng)后取產(chǎn)物2μL在2%的瓊脂糖凝膠中100V 電泳30min，紫外線照像分析光密度。

1.3.4從瓊脂糖凝膠中回收DNA①通過瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，然后用干凈的手術(shù)刀割下含需回收DNA的瓊脂塊，放入1.5ml離心管中（要盡可能使用長波長紫外光判定DNA片段的位置）。②純化回收DNA：采用天根生化科技（北京）有限公司的DNA純化回收試劑盒。按照試劑盒的操作說明書進行。

1.3.5 Real-Time PCR建立 LINE- 1DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)曲線①分別將質(zhì)粒M和質(zhì)粒U稀釋102倍、103倍、104倍、105倍，作為Real-Time PCR 的模板。②反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，一個循環(huán)；95℃變性30s， 72℃延伸30 s，40個循環(huán)。③Ct值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，只要獲得位置樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 12.0 分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩樣本均數(shù)間比較采用Student's t 檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1巨噬細(xì)胞模型的建立THP-1單核細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)48h后在顯微鏡下觀察此時細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，可見形狀不規(guī)則并有偽足伸出的巨噬細(xì)胞，見圖1。

圖1 巨噬細(xì)胞(400×)

2.2巢式降落式PCR檢測各組巨噬細(xì)胞中Line-1 DNA甲基化的變化nMS-PCR法檢測Line-1 DNA甲基化表明，不同濃度的Hcy處理細(xì)胞后，各Hcy濃度組的Line-1 DNA甲基化程度隨Hcy濃度的增高甲基化程度升高，Line-1 DNA甲基化程度與對照組比較，分別上升了1.30、1.52、1.61、2.18倍，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，其中500μmol/L組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖2)，說明Hcy可升高Line-1 DNA甲基化程度。

圖2Hcy對巨噬細(xì)胞中Line-1基因甲基化修飾狀態(tài)的影響

*P<0.05，**P<0.01，與control組相比較。

2.3 Line-1 DNA甲基化和非甲基化標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將不同濃度稀釋的甲基化和非甲基化樣品分別加入到熒光PCR體系中，按照熒光PCR體系進行操作。根據(jù)不同稀釋倍數(shù)所對應(yīng)的不同Ct值便可得到相應(yīng)的回歸方程式，即：Line-1 DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-4.3448x+51.512；非甲基化標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-2.7406x+36.208，見圖3。

3討論

動脈粥樣硬化是一種嚴(yán)重危害人類身體健康的常見病、多發(fā)病。Hcy已被公認(rèn)為是致AS的一個主要獨立危險因子，已報道的Hcy致AS的主要機制包括：促進氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥，干擾NO系統(tǒng)的功能等[2]。在AS形成過程中，巨噬細(xì)胞細(xì)胞的活化、脂質(zhì)吞噬及分泌功能的改變是AS形成的重要機制，因此，研究這些細(xì)胞功能的改變及其機制，是闡明AS形成分子機制的重要環(huán)節(jié)。

Line-1 序列中CpG二核苷酸含量豐富， CpG 是基因組甲基化的主要底物，這為人類基因組提供了甲基化的位點，而甲基化/去甲基化可以調(diào)節(jié)基因的表達，進而影響疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。本研究中，課題組在成功復(fù)制THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)上，以不同濃度Hcy作用巨噬細(xì)胞后，分別檢測了各組細(xì)胞中Line-1 DNA甲基化水平的改變，同時證實：Hcy對于巨噬細(xì)胞中Line-1 DNA甲基化水平改變有影響，并存在一定的劑量依賴關(guān)系，說明在Hcy致AS中Line-1 DNA甲基化作用顯著。課題組分別利用體外克隆技術(shù)和藍白斑篩選技術(shù)將甲基化和非甲基化的片段產(chǎn)物鏈接到T載體上，擴增后將提取的質(zhì)粒按一定的倍數(shù)稀釋。按著熒光PCR的體系進行擴增，并將不同的Ct值按對應(yīng)得稀釋倍數(shù)做出回歸方程，得到不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。雖然目前甲基化的檢測方法很多，但大體可分成兩類， 亞硫酸氫鹽修飾和甲基化敏感性限制性酶切，然后結(jié)合一些檢測方法如PCR，或核酸雜交，或瓊脂糖凝膠電泳等。結(jié)合亞硫酸氫鹽修飾的一些研究DNA 甲基化的方法比較常見[4]，如MSP 法是靠引物來識別甲基化位點的，修飾后用普通PCR 進行定性觀察，或用定量PCR 提高實驗的精確度，方法中每條引物必須覆蓋3 個以上的CpG 位點，且這些位點需要同時甲基化或同時去甲基化才能分別被M 引物或U 引物識別并擴增[5]；本研究將甲基化敏感性限制性酶切與定量PCR 相結(jié)合，用于檢測Line-1 DNA甲基化水平。該方法雖不及甲基化基因芯片或全基因組甲基化測序等獲得的信息多，但是本方法簡便易行，花費遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于基因芯片或全基因組測序，適合大批量如臨床標(biāo)本的檢測。本方法簡單易行、可操作性強、檢測范圍廣，因此更易于推廣。

用標(biāo)注曲線法檢測Line-1 某一個或某幾個CpG 位點在AS這種\"慢性腫瘤\"中的甲基化水平或許能找到預(yù)測早期的分子標(biāo)志物，當(dāng)然，這需要在未來開展大量的工作和深入而廣泛的研究。

參考文獻：

[1]楊永宗.動脈粥樣硬化性心血管病基礎(chǔ)與臨床[M].科學(xué)出版社.

[2]柏慶利.動脈粥樣硬化的獨立危險因素:同型半胱氨酸和黏附分子相關(guān)性研究[J].中國臨床康復(fù)，2003，7(24):3286-3287.

[3]Y Quentin. A master sequence related to a free left Alu monomer (FLAM) at the origin of the B1 family in rodent genomes [J]. Nucleic Acids Research， 1994， 22: 2222-2227.

[4]Li LC． Designing PCR primer for DNA methylation mapping[J].Methods Mol Biol，2007，402：371－384.

[5]Shames DS，Minna JD，Gazdar AF． Methods for detecting DNA methylation in tumors：from bench to bedside ［J］．Cancer Lett，2007，251（2）：187－198.

編輯/申磊