摘要：目的觀察并分析脂肪酸結(jié)合蛋白4(Fatty acid binding protein， FABP4)對THP-1單核源性泡沫細(xì)胞膽固醇的影響。方法將THP-1單核細(xì)胞與佛波酯(PMA)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共同培養(yǎng)，復(fù)制泡沫細(xì)胞模型，油紅O染色檢測泡沫細(xì)胞的形成。運(yùn)用FABP4腺病毒質(zhì)粒(Ad-FABP4)感染泡沫細(xì)胞，設(shè)立空病毒對照組(Ad-GFP)和正常對照組(control)，采用熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測泡沫細(xì)胞感染Ad-FABP4后其mRNA表達(dá)變化；采用酶法測定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)的含量變化，觀察FABP4對THP-1單核源性泡沫細(xì)胞膽固醇的影響。結(jié)果油紅O染色檢測泡沫細(xì)胞模型建立成功，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)泡沫細(xì)胞感染Ad-FABP4后FABP4 mRNA水平較Ad-GFP組升高了10.37倍(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用酶法測定TC、FC、CE含量的變化，發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，Ad-FABP4組泡沫細(xì)胞內(nèi)TC和CE含量分別升高0.69倍和4.06倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，F(xiàn)C含量無明顯改變。結(jié)論 FABP4可能參與THP-1單核源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積過程。

關(guān)鍵詞：泡沫細(xì)胞；脂肪酸結(jié)合蛋白4；總膽固醇；游離膽固醇；膽固醇酯

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一類以脂代謝紊亂為主的多基因復(fù)雜性疾病，發(fā)病率高，危害性大，目前尚無有效的治療方法[1]。泡沫細(xì)胞是動脈粥樣斑塊的主要成分，也是早期AS的一個典型病理特征[2]。脂肪酸結(jié)合蛋白4(Fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP4)是一類分子量較小且對脂肪酸有高親和力的可溶性載體蛋白，廣泛參與脂肪酸的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在ApoE-/-鼠同時敲除FABP4基因能明顯減少AS形成，提示FABP4與AS密切相關(guān)[4]。然而，F(xiàn)ABP4是否對單核源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇有影響尚未見報道。本實(shí)驗通過使泡沫細(xì)胞感染腺病毒FABP4后，觀察并分析FABP4過表達(dá)后對單核源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的影響，探討FABP4在泡沫細(xì)胞形成過程中的作用機(jī)制。

1資料與方法

1.1儀器和試劑超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；相差顯微鏡(日本Nikon公司)；CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；熒光定量PCR儀(上海Funglyn)；Mode l680型全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。THP-1單核細(xì)胞株(本實(shí)驗室凍存)；RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；佛波酯(PMA) (Sigma公司)；ox-LDL(廣州奕源生物科技有限公司)；油紅O染色試劑盒(南京建成生物研究所)；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均(北京天根生化科技有限公司)；總膽固醇(TC)試劑盒、游離膽固醇(FC)試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 THP-1單核源性泡沫細(xì)胞培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，以4×106個/mL細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶，加入含有終濃度為500 nmol/L PMA的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，棄去舊培養(yǎng)液，更換為含終濃度為50 mg/L ox-LDL的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗。

1.3泡沫細(xì)胞油紅O染色將最終培養(yǎng)好的細(xì)胞用PBS緩沖液洗三次，10%多聚甲醛固定10 min，60%乙醇浸泡1 min，油紅O染色10 min，60%異丙醇分色3 min，雙蒸水洗5 min，蘇木素染色1 min，雙蒸水洗待干后用水性封固劑封片，顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，即泡沫細(xì)胞形成。

1.4腺病毒FABP4感染泡沫細(xì)胞將狀態(tài)良好的單核細(xì)胞在6孔板中每孔接種1×105個細(xì)胞，使用PMA和ox-LDL分別刺激48 h后使其分化為泡沫細(xì)胞，將細(xì)胞分為兩組，每組3個孔，按照病毒量MOI=50，分別添加80 μL滴度為1×108的FABP4腺病毒載體(Ad-FABP4)和對照病毒載體(Ad-GFP)；感染2 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h行后續(xù)實(shí)驗。

1.5熒光定量PCR檢測泡沫細(xì)胞感染腺病毒FABP4后其mRNA表達(dá)改變收集細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。通過primer 5軟件設(shè)計FABP4熒光定量PCR引物：上游引物：5'-CCTTTGTGGGAACCTGGAA-3'，下游引物：5'-CTGTCGTCTGCGGTGATT-3'，產(chǎn)物長度為225 bp。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，上、下游引物各1 μL，sybe green Mix 12.5 μL，加入無RNA酶水補(bǔ)足25μL。條件：94 ℃ 10 min 1個循環(huán)，94 ℃ 15 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。根據(jù)目的基因的相對量=2－△△Ct計算結(jié)果。

1.6泡沫細(xì)胞感染腺病毒FABP4后細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE含量測定用橡皮刮子刮下感染后的泡沫細(xì)胞，PBS洗滌3次，按照試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測細(xì)胞內(nèi)TC、FC含量，CE=TC－FC。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用Prism 5.0軟件包進(jìn)行分析，結(jié)果以x±s表示。兩樣本均數(shù)間比較采用Student's t檢驗，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗，組間的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 THP-1單核源性泡沫細(xì)胞的鑒定THP-1單核細(xì)胞經(jīng)PMA刺激48 h后，細(xì)胞由懸浮變?yōu)橘N壁狀態(tài)，形狀呈長梭形或不規(guī)則形并有偽足伸出，即單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。再給予ox-LDL刺激48 h后，油紅O染色見細(xì)胞體積增大，胞內(nèi)充滿大量紅色脂滴，呈泡沫樣改變，細(xì)胞核呈藍(lán)色，即單核源性泡沫細(xì)胞形成，見圖1。

圖1THP-1單核源性泡沫細(xì)胞油紅O染色(200×)

2.2熒光定量PCR檢測腺病毒FABP4感染泡沫細(xì)胞后其mRNA表達(dá)改變腺病毒FABP4感染泡沫細(xì)胞后，Ad-FABP4組FABP4 mRNA的表達(dá)比正常對照組升高了10.37倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01)；而Ad-GFP組中FABP4 mRNA表達(dá)變化與正常對照組無顯著性差異。說明Ad-FABP4成功感染泡沫細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，見圖2。

圖2腺病毒FABP4感染泡沫細(xì)胞后檢測其mRNA表達(dá)改變

2.3腺病毒FABP4感染泡沫細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE含量分析腺病毒FABP4感染泡沫細(xì)胞后，Ad-FABP4組TC、CE含量明顯升高，較正常對照組分別增加0.69倍、4.06倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01)，而泡沫細(xì)胞過表達(dá)FABP4后細(xì)胞內(nèi)FC改變不明顯，見圖3。

3討論

動脈粥樣硬化(AS)是心血管疾病的一個重要的特征性基礎(chǔ)病變，泡沫細(xì)胞形成是AS發(fā)生的早期特征和關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。在AS過程中，來自血液循環(huán)中單核細(xì)胞遷移進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞間隙，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬大量修飾的脂蛋白，尤其是氧化低密度脂蛋白(ox－LDL)，使得細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝失衡，膽固醇酯合成增加，分解減少，以脂滴的形式大量聚集在細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝障礙，最終形成泡沫細(xì)胞[6]。泡沫細(xì)胞形成和死亡所釋放出的膽固醇，是動脈粥樣斑塊的主要成分，而膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)的失衡貫穿于泡沫細(xì)胞形成的整個過程。因此，明確泡沫細(xì)胞膽固醇流出及細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量對于評價AS的嚴(yán)重程度具有重要意義。

FABP4也稱為Ap2、ALBP或A-FABP，是脂肪酸結(jié)合蛋白家族中研究最多的一員，其主要在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，在甘油三酯形成及脂解過程中參與調(diào)控脂類生成或溶解過程[7]。近年來FABP4被證明心血管動脈粥樣硬化癥等疾病密切相關(guān)[8]。那么FABP4是否影響泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量最終導(dǎo)致AS發(fā)生還有待研究。

本實(shí)驗運(yùn)用油紅O染色鑒定，成功復(fù)制THP-1單核源性泡沫細(xì)胞模型，通過感染腺病毒FABP4使其過表達(dá)后檢測泡沫細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE的變化，發(fā)現(xiàn)泡沫細(xì)胞過表達(dá)FABP4后細(xì)胞內(nèi)TC、CE明顯升高，而FC改變不明顯，提示FABP4在泡沫細(xì)胞膽固醇聚集或轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。這種可能的機(jī)制為FABP4可阻斷或逆轉(zhuǎn)脂肪酸及其?；?CoA調(diào)控的其他酶從而發(fā)揮作用；同時，前期研究發(fā)現(xiàn)泡沫細(xì)胞膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶A1(ABCA1)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ABCA1)表達(dá)改變共同作用導(dǎo)致了膽固醇沉積和甘油三酯脂解降低[9]；因此，推測泡沫細(xì)胞FABP4高表達(dá)可能影響了在細(xì)胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用的酶ABCA1或ACAT1等影響泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量變化。這為我們進(jìn)一步研究AS形成中泡沫細(xì)胞大量聚集提供了新的實(shí)驗基礎(chǔ)。

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編輯/申磊