摘要：目的 探究BRAF基因及其突變與甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)患者相關(guān)參數(shù)之間的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化、PCR及基因測(cè)序技術(shù)對(duì)92例PTC患者，10例非PTC甲狀腺惡性腫瘤患者、59例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的新鮮標(biāo)本進(jìn)行BRAF蛋白表達(dá)情況、BRAF基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)。分析BRAF基因突變與患者年齡、性別、腫瘤直徑、有無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)包膜、超聲征象等臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果 92例PTC中30例檢出BRAF突變基因，而在對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)突變。BRAF基因突變與PTC甲狀腺腫瘤直徑相關(guān)性顯著，與性別、發(fā)病年齡、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無(wú)關(guān)。結(jié)論 BRAF基因突變與腫瘤直徑大小相關(guān)性顯著，突變可能影響PTC患者遠(yuǎn)期預(yù)后。

關(guān)鍵詞：甲狀腺乳頭狀癌；BRAF基因突變預(yù)后

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌腺惡性腫瘤，并且其近年的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，無(wú)論是全球范圍還是在國(guó)內(nèi)[1]，正逐漸引起研究者的重視。根據(jù)腫瘤切除術(shù)后的病理結(jié)果，我們可以將其分為4個(gè)類型：乳頭狀腺癌、濾泡癌、髓樣癌、未分化癌。其中以甲狀腺乳頭狀癌( papillarythyroidcarcinoma，PTC) 的發(fā)病率最高，占所有甲狀腺惡性腫瘤的80%[2]。鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體基因（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1， BRAF），位于7q23染色體，是RAF基因家族的成員之一。其編碼一個(gè)由783個(gè)氨基酸組成的蛋白，是一種特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞通路RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK中，起到激活MEK/ERK的重要作用，控制細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等進(jìn)程[3]。BRAF基因外顯子15如果出現(xiàn)單核苷酸突變（T1799A），則其相應(yīng)的產(chǎn)物蛋白中，谷氨酸取代對(duì)應(yīng)的纈氨酸（V600E），使蛋白成為活化蛋白激酶，激活下游有絲分裂信號(hào)，形成腫瘤[4]。經(jīng)過近幾年的研究，人們發(fā)現(xiàn)PTC中存在高頻率的BRAF突變，并且這種突變與PTC的病因、臨床表現(xiàn)、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為、病理診斷、治療策略的選擇、近遠(yuǎn)期預(yù)后等方面都具有明顯的相關(guān)性[5]。本文對(duì)本院今年來的PTC患者進(jìn)行BRAF基因突變檢測(cè)，并就上述問題進(jìn)行分析研究，以期對(duì)臨床治療具有指導(dǎo)意義。

1資料與方法

1.1一般資料實(shí)驗(yàn)組：選取2011年1月~2013年6月在本院臨床考慮為甲狀腺乳頭狀癌，且行手術(shù)切除，并經(jīng)病理科確診患者92例。見表1。對(duì)照組1：選取2011年1月~2013年6月就診于本院的患者，具體為7例濾泡癌、2例髓樣癌、1例未分化癌。對(duì)照組2：同時(shí)期于本院診斷為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的患者59例。兩組對(duì)照組的性別構(gòu)成、年齡構(gòu)成與實(shí)驗(yàn)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

以上患者診斷皆由本院基本外科甲狀腺組教授予臨床診斷，由本院病理科教授按WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷。

1.2標(biāo)本處理手術(shù)切除腫瘤組織后30min內(nèi)，由病理科醫(yī)生從標(biāo)本腫瘤部位切取腫瘤組織（正常組的標(biāo)本取自結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者切除腫物周邊的正常組織），取大部組織進(jìn)行石蠟包埋切片，完成病理診斷、免疫組化檢測(cè)，取部分組織（約0.5×0.5×0.5cm）用于突變基因檢測(cè)（詳見后文），剩余組織用液氮封存于標(biāo)本管中。

1.3試劑實(shí)驗(yàn)采用鼠抗人單克隆抗體（克隆號(hào)：EPl52Y，購(gòu)于福建邁新生物有限公司）作為BRAF抗體；免疫組化試劑盒購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；PCR反應(yīng)所用試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；檢測(cè)BRAF基因突變所需使用的DNA抽提試劑盒購(gòu)自北京博凌科為生物科技有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1免疫組化采用SABC法，利用PBS代替一抗為陰性對(duì)照，采用明確BRAF陽(yáng)性的大腸癌切片為陽(yáng)性對(duì)照。步驟如下：取4μm厚切片，常規(guī)方法脫蠟，加入檸檬酸溶液后煮沸10 min，放至室溫，加入3％H2O2甲醇液以失活內(nèi)源性過氧化物酶，加入BRAF抗體，室溫靜置5h后用PBS洗滌2次，加入二抗，室溫靜置2h后用PBS洗滌2次，使用DAB顯色，使用蘇木精復(fù)染，脫水后使用二甲苯透明、使用中性樹膠封固。

結(jié)果判斷：顯微鏡下觀察細(xì)胞核顏色為棕黃色者即提示BRAF蛋白陽(yáng)性。依次閱讀每一張切片，隨機(jī)觀察10個(gè)視野，陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞占全體腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比≥10%為陽(yáng)性，反之即為陰性。

1.4.2基因突變的檢測(cè)①DNA的提取：取前文所述標(biāo)本，根據(jù)DNA抽提試劑盒所述步驟，提取DNA于-20℃冰箱保存；②PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段：引物源自華大基因公司，正向引物5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3'，反向引物5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'，擴(kuò)增后目標(biāo)片段長(zhǎng)度為218bp；PCR反應(yīng)體系為：總體積50μL，其中dNTP（5mmol/L） 6μL、DNA聚合酶（10U/μL）0.4μL、模板DNA 3μL、正反引物(15μmol/L)各1.0μL、擴(kuò)增緩沖液(10×)5μL、雙蒸水33.6μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，59℃退火30s，70℃延伸45s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后72℃延伸20min后結(jié)束；③電泳檢測(cè)：取步驟②所得PCR產(chǎn)物7.0μL，加入緩沖液1.0μL混合，以DNA標(biāo)記物1.0μL作為對(duì)照，在2％瓊脂凝膠中進(jìn)行電泳，并用EB染色；④PCR產(chǎn)物測(cè)序：由華大基因測(cè)序。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 BRAF蛋白表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)組中，共92例確診PTC患者，其中BRAF蛋白表達(dá)陽(yáng)性者為68例，占比73.9%。其中：男性20例陽(yáng)性（陽(yáng)性率74.1%），女性48例陽(yáng)性（陽(yáng)性率73.8%），差異不顯著；≤55歲者22例陽(yáng)性（陽(yáng)性率91.7%），＞55歲者46例陽(yáng)性（陽(yáng)性率67.6%），差異具有顯著性；腫瘤直徑≤5mm者有23例陽(yáng)性（陽(yáng)性率54.8%），腫瘤直徑＞5mm者45例陽(yáng)性（陽(yáng)性率90.0%），差異顯著；出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移者47例陽(yáng)性（陽(yáng)性率80.0%），未出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移者12例陽(yáng)性（陽(yáng)性率63.6%），差異不顯著；出現(xiàn)點(diǎn)狀鈣化者19例陽(yáng)性（陽(yáng)性率70.4%），未出現(xiàn)點(diǎn)狀鈣化者49例陽(yáng)性（陽(yáng)性率75.4%），差異不顯著；有包膜者15例陽(yáng)性（陽(yáng)性率68.2%），無(wú)包膜者53例陽(yáng)性（陽(yáng)性率75.7%），差異不顯著。見表1。

對(duì)照組中僅有1例濾泡癌患者出現(xiàn)BRAF蛋白陽(yáng)性表達(dá)(陽(yáng)性率14.3%)， 其余所有對(duì)照均陰性表達(dá)。

2.2 BRAF基因T1799A突變實(shí)驗(yàn)組中，共有92例確診PTC患者，其中BRAF基因突變者為30例，突變陽(yáng)性率32.6%。進(jìn)一步分析突變基因堿基改變，為第1799位點(diǎn)的胸腺嘧啶被腺嘌呤所取代，即T1799A（圖1）；從蛋白表達(dá)角度考慮，所有突變者均陽(yáng)性表達(dá)BRAF蛋白。具體分析：男性8例發(fā)生突變（突變率29.6%），女性22例發(fā)生突變（突變率33.8%），差異不顯著；≤55歲者6例發(fā)生突變（突變率25.0%），＞55歲者24例發(fā)生突變（突變率35.3%），差異不顯著；腫瘤直徑≤5mm者有7例發(fā)生突變（突變率16.7%），腫瘤直徑＞5mm者23例發(fā)生突變（突變率46.0%），差異顯著；出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移者20例發(fā)生突變（突變率33.9%），未出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移者10例發(fā)生突變（突變率30.3%），差異不顯著；出現(xiàn)點(diǎn)狀鈣化者11例發(fā)生突變（突變率40.7%），未出現(xiàn)點(diǎn)狀鈣化者19例發(fā)生突變（突變率29.2%），差異不顯著；有包膜者9例發(fā)生突變（突變率40.9%），無(wú)包膜者21例發(fā)生突變（突變率30.0%），差異不顯著。見表1。

對(duì)照組中所有病例均未檢測(cè)出突變。

圖1PTC基因測(cè)序

3討論

2002年，研究者第一次在惡性黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了BRAF基因的突變[6]，其后，BRAF基因突變被多次發(fā)現(xiàn)于不同的腫瘤組織內(nèi)，而其在PTC中的陽(yáng)性率僅次于惡性黑色素瘤，文獻(xiàn)[6]報(bào)道其突變率可達(dá)30%～83%。這種突變的出現(xiàn)具有一定的特異性，即其他甲狀腺惡性腫瘤中極少檢測(cè)到BRAF基因的突變。從本次實(shí)驗(yàn)得到的PTC組BRAF基因的突變率為32.6%，與已有的文獻(xiàn)報(bào)道是相符合的。

作為甲狀腺惡性腫瘤中發(fā)病率最高的那種，PTC的預(yù)后也是其中最好的，特別是得益于近年甲狀腺超聲技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，大部分患者都能在較早期得到診斷和治療，通過手術(shù)結(jié)合131 I放射治療可以取得非常好的療效，但遺憾的是，仍然有部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況。因此，為了更好地判斷PTC患者的遠(yuǎn)期預(yù)后，就極有必要去研究患者年齡、性別、腫瘤直徑、有無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)包膜、超聲征象等等影響其遠(yuǎn)期預(yù)后的因素[7]。和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，BRAF基因正式研究這些因素的一把鑰匙。綜合BRAF蛋白表達(dá)、BRAF基因突變的結(jié)果，我們認(rèn)為腫瘤直徑與BRAF基因的相關(guān)性較為顯著，腫瘤直徑≤5mm者有7例發(fā)生突變（突變率16.7%），腫瘤直徑＞5mm者23例發(fā)生突變（突變率46.0%），腫瘤直徑大者BRAF基因的突變率明顯較高，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著。

此外，本研究也探討了BRAF蛋白在PTC患者中得情況。從結(jié)果來看，PTC患者BRAF蛋白的表達(dá)率為73.9%。結(jié)合其在余下甲狀腺惡性腫瘤中得表達(dá)率（僅濾泡癌中有14.3%，其余未見表達(dá)），可以認(rèn)為BRAF蛋白在甲狀腺腫瘤的病理診斷方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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編輯/哈濤