摘要：目的 對(duì)先天性心臟病患者Nkx2.5基因進(jìn)行突變觀察及關(guān)聯(lián)研究。方法 分別對(duì)50例先天性心臟病病例及50例對(duì)照組Nkx2.5基因全部外顯子擴(kuò)增并測序。結(jié)果 在Nkx2.5識(shí)別出了1個(gè)不改變氨基酸的單核甘酸多態(tài)，即c.63A>G多態(tài)，但此多態(tài)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 Nkx2.5基因的c.63A>G多態(tài)可能與CHD有關(guān)。

關(guān)鍵詞：Nkx2.5；先天性心臟病；基因突變；單核苷酸多態(tài)性

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是一類因胚胎期心血管系統(tǒng)發(fā)育異常所引起的先天畸形，也是全世界范圍內(nèi)最常見的出生缺陷之一，遺傳因素在CHD發(fā)病中起重要作用。Nkx2.5是心臟發(fā)育及形成的主要相關(guān)基因，它的單個(gè)或多個(gè)基因的突變，均會(huì)導(dǎo)致心臟畸形的發(fā)生。本研究將從分子水平上對(duì)Nkx2.5基因在進(jìn)行研究和探討，旨在揭示心臟發(fā)育相關(guān)基因Nkx2.5突變與中國CHD發(fā)病的關(guān)系，為預(yù)防先天性心臟病的發(fā)生提供可靠科學(xué)依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料2011年1月~6月江西省兒童醫(yī)院心臟中心收治的CHD患者共50例，男27例，女23例；包括室問隔缺損(VSD)38例、房間隔缺損(ASD)4例、肺動(dòng)脈瓣狹窄(Ps)1例、法洛氏四聯(lián)征(TOF)1例、復(fù)雜CHD6例，均由手術(shù)證實(shí)。選擇性別、年齡與CHD患者相匹配的正常人50例為對(duì)照組，其中男28例，女22例；均經(jīng)彩色超聲心動(dòng)圖檢查排除CHD。

1.2基因組DNA制備抽取受檢者外周血2~3ml，采用乙二胺四乙酸（EDTA）鹽抗凝，-80℃保存；使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取外周靜脈血gDNA。

1.3引物設(shè)計(jì)利用Primer5.0軟件對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫中NKX2.5基因的gDNA序列(登陸號(hào)：NT_023133)的外顯子設(shè)計(jì)引物（引物序列：外顯子1上游引物5'-AAACTGCTCATCGCTCCTGT-3'，下游引物5'-CCTGAGTTTCTTGGGGACG-3'；外顯子2因較大設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別為2a上游引物5'-GTCAAGCCGCTCTTACCAA-3'，下游引物5'-GGGGCTCTGAACCGCAT-3'，2b上游引物5'-CCGCCGCCAACAACAACT-3'，下游引物5'-GCCGCAAGCTGAAAGAA-3'），引物由上海捷瑞生物工程公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增及測序50uL PCR反應(yīng)體系中，取DNA模板4ug、上下游引物各2ug，2×Tap PCR MasterMix 26ul，ddH2O 18ul，采用美國伯樂公司PT-200DNA擴(kuò)增儀自動(dòng)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃ 3min，變性94℃ 30sec，退火55℃ 30sec，延伸72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)，終延伸72℃ 5min。所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均由深圳華大基因公司進(jìn)行純化及測序。不一致者重新3次PCR擴(kuò)增后作正、反義鏈測序驗(yàn)證。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。分析等位基因及各基因型在CHD患者和正常對(duì)照者間的頻率分布，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1識(shí)別出一個(gè)NKX2.5基因多態(tài)在NKX2.5基因中識(shí)別出1個(gè)不改變氨基酸的單核甘酸多態(tài)，即NKX2.5基因編碼序列第63位的腺嘌呤變?yōu)轼B嘌呤，相應(yīng)的第21位的密碼子由GAA變?yōu)镃AG，但所編碼的氨基酸不變，仍為谷氨酸（glutamic acid，glu），稱為c.63A>G多態(tài)(圖1)。

圖1正常對(duì)照者和突變攜帶者NKX2.5基因的c．63A>G多態(tài)比較

a：為NKX2.5基因c.63A>G純合子A/A的序列；b：為NKX2.5基因c.63A>G雜合子A/G的序列；c：為NKX2.5基因c.63A>G純合子G/G的序列；箭頭為多態(tài)位點(diǎn)

2.2NKX2.5基因多態(tài)性分析在NKX2.5基因編碼序列第63位點(diǎn)的等位基因G、A及其構(gòu)成的三種基因型AA、AG、GG在50例CHD患者和50名健康對(duì)照者間的頻率分布(χ2=5.483，P=0.064)、等位基因頻率比較(χ2=0.87，P=0.768)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

3討論

NKX2.5基因又稱為心臟特異性同源盒基因，定位于染色體5q35上，包含兩個(gè)外顯子，編碼324個(gè)氨基酸，分子量為35ku，兩個(gè)外顯子之間有1.5Kb的內(nèi)含子，在進(jìn)化中高度保守。NKX2.5基因由N端的TN結(jié)構(gòu)域、中部的同源結(jié)構(gòu)域和C端的NK2特異性結(jié)構(gòu)域3部分構(gòu)成，其中外顯子2上有一個(gè)含有60個(gè)(138～197位)高度保守氨基酸組成的同源結(jié)構(gòu)域，其三維結(jié)構(gòu)是由3個(gè)a-螺旋組成，螺旋II和III形成一個(gè)螺旋一轉(zhuǎn)角一螺旋結(jié)構(gòu)，NKX2.5通過螺旋III與目的基因中特異性的DNA序列5'-T(C／T)AAGTG-3'結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性。一旦同源結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，就會(huì)直接導(dǎo)致突變蛋白與DNA的結(jié)合活性下降，引起心臟畸形[1-3]。

本研究對(duì)NKx2.5基因進(jìn)行突變研究，未發(fā)現(xiàn)任何突變，但識(shí)別出1個(gè)單核甘酸多態(tài)，即c.63A>G多態(tài)，此多態(tài)在正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組皆有發(fā)現(xiàn)，且不改變氨基酸并差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果與石琳[4]等發(fā)現(xiàn)c.63A>G多態(tài)在VSD、TOF組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及韓增強(qiáng)[5]等研究提示此多態(tài)在ASD組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義結(jié)果不一致，考慮原因可能是由于樣本量少及地域性差異所致。此同義突變雖不改變氨基酸表達(dá)，但由于位于編碼區(qū)，可能對(duì)NKX2.5mRNA的剪接、穩(wěn)定性造成影響，從而影響蛋白質(zhì)量的表達(dá)導(dǎo)致先天性心臟病。此觀點(diǎn)可通過擴(kuò)散樣本量及轉(zhuǎn)錄水平的研究進(jìn)一步證實(shí)。因此，Nkx2.5基因的c.63A>G多態(tài)可能與CHD有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Raffin M，Leong L M，Rones M S，et al．Subdibivision of the cardiac Nkx2.5 expression domain into myogenic and nonmyogenic compartments[J].Dev Biol，2000，218(2)：326-340.

[2]Reamon-Buettner SM，Borlak J.NKX2-5: an update on this hypermutable homeodomain protein and its role in human congenital heart disease (CHD)[J].Hum Mutat，2010，31(11):1185-1194.

[3]Akazawa H，Komuro I.Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5:Its role in cardiac development and diseases[J].Pharmacol Ther，2005，107(2):252-268.

[4]石琳，申阿東，李曉峰，等.中國先天性心臟病Nkx2．5基因突變篩查及關(guān)聯(lián)研究[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(5):525-527.

[5]韓增強(qiáng)，唐胤，陳彧，等.81例單純性先天性心臟病患者Nkx2.5基因突變篩查及關(guān)聯(lián)研究[J].中國循環(huán)雜志，2011，26(6):461-464.編輯/哈濤