摘要：目的 探討喉鱗狀細胞癌腫瘤微環(huán)境對人樹突狀細胞發(fā)育的影響，為DC疫苗在喉癌中的治療提供新思路。方法 通過提取喉癌組織勻漿上清液體外模擬腫瘤微環(huán)境，提取誘導和培養(yǎng)人樹突狀細胞細胞，并采用檢測人樹突狀細胞表型與CD1a表達。結(jié)果 喉癌勻漿上清組DC細胞突起較癌旁勻漿上清組少，誘導后DC細胞CD11c、CD86、CD1a均明顯下降。結(jié)論 喉鱗狀細胞癌腫瘤微環(huán)境可能對DC細胞分化、發(fā)育具有重要影響。

關(guān)鍵詞：腫瘤微環(huán)境；DC；樹突狀細胞

Study on Tumor Laryngeal Squamous Cell Cancer Microenvironment Effect on the Differentiation and Development of Dendritic Cells

CHEN Zi-hui1，HE Long2

(1.Guangzhou Second People's Hospital of Panyu District，Guangzhou 511431，Guangdong，China;2.The First People's Hospital of Guangzhou City，Guangzhou 510000，Guangdong，China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of microenvironment on dendritic cell tumor development of laryngeal squamous cell carcinoma， to provide new ideas for the treatment of DC vaccine in laryngeal carcinoma.MethodsBy extracting the laryngeal carcinoma tissue homogenate supernatant liquid simulation of tumor microenvironment， induced and cultured cells from human dendritic cells， and the detection of human dendritic cell phenotype and CD1a expression.Results Laryngeal carcinoma supernatant; group DC cell processes were adjacent homogenate supernatant group， induced DC cells CD11c， CD86， CD1a decreased significantly.Conclusion Tumor laryngeal squamous cell cancer microenvironment may have an important influence on the development of DC cell differentiation.

Key words：Tumor microenvironment;DC;Dendritic cells

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取20例于2012年5月~12月在廣州市番禹區(qū)大石人民醫(yī)院入院的喉鱗狀細胞癌患者手術(shù)癌組織以及癌旁組織各200mg。

1.2 試劑與設(shè)備Hep-2細胞（武漢博士德生物）、生理鹽水（上海紫一）、1640培養(yǎng)液（Gibico/USA）、PBS（上海紫一）；

SUNRISE酶標儀（奧地利Tecan）

1.3 方法

1.3.1 取術(shù)前無化療、放療史患者手術(shù)切除喉癌組織200mg，癌旁5mm處取癌旁組織5mg，共20組40例樣本。將組織樣本在含有200mg/ml青霉素與鏈霉素的生理鹽水中浸泡20min，終濃度為200mg/ml。組織勻漿機研磨后于4000rpm/min離心30min，取上清保存于-20℃?zhèn)溆肹1]。

1.3.2 雙抗體夾心ELISA法檢測喉癌及癌旁組織勻漿清液VEGF-A標準品依次倍比稀釋并設(shè)復孔，每份癌及癌旁勻漿上清均設(shè)復孔對照。450nm條件下測定VEGF-A濃度。

1.3.3 常規(guī)培養(yǎng)并收集Hep-2細胞，PBS洗兩遍后調(diào)細胞懸液濃度為1×1010/L，4℃離心收集上清液，過濾后按照Brad-ford蛋白質(zhì)定量法制作標準曲線，測定抗原濃度，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 密度梯度離心分離人外周血單個核細胞，1640培養(yǎng)液誘導DC，過夜后繼續(xù)誘導。設(shè)喉癌勻漿上清組、癌旁勻漿上清組組，均隔天半量換液，第4d加入喉癌細胞株Hep-2抗原，第6d加入脂多糖，第8d收集各組細胞，觀察DC細胞形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有結(jié)果均采用SPSS16.0軟件分析，并行One-way ANOVA分析。

2 結(jié)果

細胞經(jīng)培養(yǎng)后逐漸從聚集狀態(tài)變成懸浮分散生長狀態(tài)，4~5d時可見細胞有短毛刺狀突起，第8d時可見癌旁勻漿上清組表面有大量毛刺狀突起，而喉癌勻漿上清組DC細胞數(shù)量增多但毛刺狀突起不明顯（見圖1）。

圖1 喉癌勻漿上清組(左圖)與癌旁勻漿上清組(右圖)DC細胞顯微鏡下形態(tài)

人外周血單個核細胞誘導后DC細胞CD11c、CD86、CD1a表達分別從360.01±9.29、169.01±6.07、700.01±6.77下降為37.99±6.15、57.99±3.18、49，89±7.38，P值均小于0，01，差異顯著。

3討論

本研究中可以發(fā)現(xiàn)，人外周血單個核細胞可以誘導癌旁勻漿上清液中的DC細胞分化，其細胞結(jié)構(gòu)均明顯區(qū)別于喉癌勻漿上清液中的DC細胞。大量樹突狀突起是DC細胞成熟的標志之一；免疫分子表型均出現(xiàn)明顯下降，進一步說明DC形態(tài)結(jié)構(gòu)的缺失與相關(guān)免疫分子表達密切相關(guān)，標志著相關(guān)免疫功能的缺失，腫瘤細胞成功免疫逃逸。VEF-A與DC前體細胞表達的受體結(jié)合后可抑制DC細胞分化發(fā)育所需轉(zhuǎn)錄因子活化，組織DC細胞成熟。

因此，DC細胞作為人體內(nèi)功能強大的專治抗原提呈細胞，對免疫反應(yīng)的啟動、進展以及免疫耐受的誘導起著至關(guān)重要的作用[2，3]。喉鱗狀細胞癌腫瘤微環(huán)境很可能參與到DC細胞分化、發(fā)育過程中，調(diào)節(jié)DC細胞免疫應(yīng)答，對腫瘤免疫逃逸、轉(zhuǎn)移具有重要影響。

參考文獻：

[1] Su X， Ye J， Hsueh EC， et al. Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells[J]. J Immunol， 2010， 184(3): 1630-41.

[2] Hanahan D， Weinberg RA. Hallmarks of cancer:the next generation[J]. Cell，2011，144(5):646-674.

[3] Bernhard E J．Interventions that induce modifications in the tumor microenvironment[J]. Cancer Radiother，2011， 15(5):376-82.編輯/許言