摘要：目的 探討分析急性白血病（AL）患者外周網(wǎng)織血小板（RP）的檢測方法以及RP檢測的臨床意義。方法 收集我院血液內(nèi)科2011年9月~2013年9月住院并接受化療的AL患者30例，用流式細(xì)胞儀（FCM）動態(tài)檢測AL患者的RP、外周血血小板（PLT）水平，并計算RP百分比（RP%）和RP絕對值（RPC）。并與30例體檢健康的受試者作對照。結(jié)果 治療前，AL患者的RP%和PRC均低于健康受試者，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），經(jīng)過治療后，達到臨床緩解標(biāo)準(zhǔn)的AL患者RP%和RPC與健康受試者無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論 RP%和RPC不僅可以反映骨髓PLT的生成情況，而且靈敏度比PLT計數(shù)高，因此，RP%和RPC可以作為治療AL過程中的監(jiān)測指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)織血小板；流式細(xì)胞儀；急性白血病

網(wǎng)織血小板（Reticulated Platelets，RP）是由骨髓巨核細(xì)胞釋放進入外周血液的血小板，RP不含細(xì)胞核或者DNA成分，但含有少量的信使RNA和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)用于合成少量的蛋白質(zhì)，是血液循環(huán)系統(tǒng)中最為年輕的血小板[1]。外周血經(jīng)新亞甲藍染色后在顯微鏡下觀察到的網(wǎng)狀染色無的部分即為RP。RP可以反映外周血小板（Peripheral platelet， PLT）的增生情況、更新速度和骨髓造血系統(tǒng)的細(xì)胞動力學(xué)變化，是評判PLT生成情況的重要指標(biāo)[2-3]。急性白血?。ˋcute Leukemia ，AL）患者PLT較健康者顯著減少，其原因復(fù)雜。在臨床診治過程中，骨髓功能狀態(tài)的變化比較大，PLT或者骨髓穿刺是臨床上判斷白血病患者不同疾病狀態(tài)的常規(guī)診斷方法，然而PLR升高或者骨髓造血功能的恢復(fù)存在明顯滯后的問題，檢驗誤差大，影響因素多等不足，并且多次骨髓穿刺給患者帶來難以忍受的痛苦。而采用流式細(xì)胞儀（FCM）、檢測PR具有簡單、準(zhǔn)確、外周血采集量少，無需骨髓穿刺等特點，是一種新型的診斷AL患者疾病狀態(tài)的方法。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測RP主要是利用網(wǎng)織血小板內(nèi)殘留的少量RNA，可以被多種不溶的核酸特異性熒光染料染色，其中較為好用的是噻唑橙（TO）。噻唑橙能夠透過存活的血小板細(xì)胞的細(xì)胞膜，與核酸結(jié)合，標(biāo)記噻唑橙的血小板觀察到的熒光強度顯著增強。研究表明RP百分比（RP%）和RP絕對值（RPC）能夠反應(yīng)骨髓中PLT的生成率，并且RP%能夠作為預(yù)測指標(biāo)預(yù)測外周血中PLT計數(shù)的恢復(fù)情況。

1資料與方法

1.1一般資料隨機選擇2011年9月~2013年9月我院收治的30例急性白血?。ˋL）患者作為治療組，研究對象經(jīng)免疫學(xué)、骨髓細(xì)胞學(xué)和骨髓病理學(xué)檢查證實均符合《血液病診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。其中男性17例，女性13例，患者年齡19~60周歲，中位年齡為32周歲。同時隨機選取30例體檢健康的受試者作為對照組。其中男性17例，女性13例；患者年齡20~56周歲，中位年齡為34周歲。健康受試者篩選條件：查體肝腎功能正常；心電圖正常；五分類全自動血液細(xì)胞分析儀血常規(guī)檢測結(jié)果無異常?？膳懦咧Y、腎臟疾病，肝臟疾病、心血管疾病、糖尿病。

1.2儀器與試劑噻唑橙（TO）染料（美國Sigma公司）；CD42b單克隆抗體（PE標(biāo)記）（美國BD公司）；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.3檢測方法采集靜脈血5μL，加肝素抗凝，加入10μL CD42b單克隆抗體（PE標(biāo)記），再加入梯度的TO染料（用生理鹽水稀釋），并著染不同的時間，確定好實驗條件后連續(xù)監(jiān)測標(biāo)本10次，以檢測該方法的可重復(fù)性。FACS Calibur型流式細(xì)胞儀的設(shè)門規(guī)則參考[4]等人的方法。分離PLT與紅細(xì)胞、白細(xì)胞及碎片，并用CD41b單克隆抗體來確認(rèn)PLT的比例。用對照組確定為陽性閾值，然后檢測TO染色為陽性的PLT百分比。設(shè)定PLT的檢測門，檢測獲得直方圖，按照空白對照來設(shè)置標(biāo)尺，使得TO染色呈陽性的PLT為1%，檢測20000個PLT，計數(shù)TO染色呈陽性的RP，并計算RP百分率，即RP%。RP%和PLT計數(shù)結(jié)果的乘積得到的數(shù)值記為RP絕對值，即RPC。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料均用\"均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）\"表示。數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2結(jié)果

2.1染色濃度及染色時間的篩選抽取健康受試者加油肝素的靜脈血5μL，加入10μL CD42b單克隆抗體（PE標(biāo)記）后分別再加入500μL梯度稀釋的TO（稀釋比為1:1、1:2、1:3、1:4），充分混合均勻后靜置室溫避光。在染色后10、20、30、60、90、120min時，采用流式細(xì)胞儀檢測RP%。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)TO濃度比為1:2，染色時間為30min時，RP%的穩(wěn)定性最高，是染色的最佳實驗條件。

2.2 RP%和PRC的檢測結(jié)果采用上確定好的實驗條件來檢測對照組和治療組的外周血，對照組的RP%核RPC的檢測結(jié)果為（17.49±9.31）%和（39.23±17.34）；治療組的檢測結(jié)果分別為（4.52±3.10）%和（1.32±0.89）。治療組的RP%和RPC的檢測值均小于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 AL患者治療后的RP%和RPC檢測結(jié)果經(jīng)過治療后，AL患者中臨床緩解的有21例，RP%和RPC的檢測結(jié)果為（15.23±8.23）%和（35.41±15.56）；未緩解的有9例，檢測結(jié)果為（8.74±3.37）%和（10.42±5.16）。未緩解患者的RP%和RPC檢測結(jié)果顯著小于健康受試者和臨床緩解患者，且具有顯著性差異（P＜0.05）。而臨床緩解患者的檢測結(jié)果與健康受試者相比，無顯著性差異（P＞0.05）。

3討論

化療及放療會導(dǎo)致急性白血病患者出現(xiàn)繼發(fā)性的骨髓抑制或衰竭，進而引起PLT減少，甚至出血的傾向?；熀?，急性白血病患者PLT能夠有效恢復(fù)患者外周血的PLT水平，從而預(yù)防因為PLT減少而導(dǎo)致的出血。

研究發(fā)現(xiàn)，從化療的第22d開始接受化療的AL患者外周血的PLT水平可以自行恢復(fù)，但RPC的恢復(fù)卻比PLT提前了2d，研究者認(rèn)為，因為RPC能夠提示誘導(dǎo)或者強化治療后患者骨髓造血功能的恢復(fù)情況，并能夠減少患者輸注PLT的次數(shù)，所以在化療期間，對AL患者進行RPC監(jiān)測較PLT監(jiān)測也就更有意義[5]。

目前，AL診療的依據(jù)主要是骨髓穿刺和外周血的檢查結(jié)果，然而經(jīng)過化療后，PLT的動力學(xué)變化迅速，目前還沒有相關(guān)的指標(biāo)能夠預(yù)測化療后PLT的恢復(fù)程度。實驗研究結(jié)果顯示，AL患者的RP%及RPC均低于健康受試者，臨床緩解的AL患者的RP%及RPC升高，且與健康受試者相比較無統(tǒng)計學(xué)差異，而未緩解的AL患者的RP%及RPC水平無明顯變化。

參考文獻：

[1]Kienast J，Shemitz G.Flow cyctometric analysis of thiazole orange uptake by platelets: a diagnostic acid in the evaluation of thrombocytopenic patients[J].Blood.，1990，75(1):116.

[2]Chao W，Brian RS，Kenneth A，et al.Reticulated platelet predict platelet count recovery following chemotherapy[J].Transfusion，2002，42(3):368.

[3]楊斌，曹祥山，邱國強，等.網(wǎng)織血小板檢測在特發(fā)性血小板減少性紫癜中的臨床意義[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006，26(1):120-121.

[4]Takubo T，Yamane T，Hino M，et al.Clinical significance of stimultaneous measurement of reticulated platelets and large platelets in idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Haematologia(Budap)，2000，30(3):183-192.

[5]Stohlawetz P，Stiegler G， Knobl P，et al.The rise of reticulated platelets after intensive chemotherapy for AML reduces the need for platelet transfusions[J].Ann Hematol.1999，78(2):271-273.

編輯/哈濤