摘要：目的 研究非肌層浸潤性膀胱移行細(xì)胞癌( BTCC) 和正常膀胱黏膜上皮差異表達(dá)基因。方法 采用高通量cDNA表達(dá)譜芯片對(duì)3例非浸潤性BTCC及3例正常膀胱黏膜上皮進(jìn)行檢測，篩選共同表達(dá)差異基因。結(jié)果 共篩選出274個(gè)共同差異基因，其中表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因96個(gè)，表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因178個(gè)。結(jié)論 非浸潤性BTCC癌變是多基因、多途徑、多步驟的復(fù)雜過程，高通量的基因芯片技術(shù)可以同時(shí)定量成千上萬基因表達(dá)水平，是一種高效、可靠的強(qiáng)大的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：膀胱移行細(xì)胞癌；cDNA芯片；基因

膀胱癌是我國泌尿外科臨床中最常見的惡性腫瘤，其中90%以上為膀胱移行細(xì)胞癌(bladder transitional cell carcinoma， BTCC)，大部分BTCC患者初次確診時(shí)為分化良好或中等分化的非肌層浸潤性膀胱癌，預(yù)后較好，但隨腫瘤的分級(jí)、分期的升高預(yù)后明顯變差[1]。本次實(shí)驗(yàn)采用高通量cDNA芯片檢測非肌層浸潤性BTCC及癌旁正常膀胱黏膜上皮組織的基因表達(dá)譜，篩選并分析共同差異表達(dá)基因，初步探索非肌層浸潤性BTCC癌變分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取甘肅省人民醫(yī)院泌尿外科2012年7月～2013年12月手術(shù)切除的膀胱移行細(xì)胞癌組織標(biāo)本3例，同期獲取膀胱全切患者正常膀胱黏膜作為對(duì)照（均經(jīng)病理證實(shí)） 。將所獲取的新鮮組織樣本，立即在液氮中冷凍并儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩?例膀胱癌患者中， 其中男性2例，女性1例，年齡46～71歲，平均57歲，所有患者術(shù)前均未做放療、化療。病理分級(jí): G1 2例、G2 1例。TNM分期: T1 3例。

1.2 標(biāo)本總RNA抽提、純化和質(zhì)檢按照Trizol試劑 ( Invitrogen公司，US)提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取組織塊中的總RNA ， 通過氯仿-異丙醇沉淀法回收，最后用紫外分光光度計(jì)檢測樣本A 260/280及總量， 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。

1.3 芯片雜交、清洗染色及掃描檢測采用Affymetrix公司HG U219表達(dá)譜芯片，芯片可檢測約20，000個(gè)功能確定、有完整注釋基因的36，000個(gè)轉(zhuǎn)錄本。取上述鑒定合格的總RNA樣本，以O(shè)ligo(dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，以第一條鏈為模板合成雙鏈cDNA。用RNA 擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄并熒光素標(biāo)記cRNA，再用RNA 純化試劑盒進(jìn)一步純化， 之后合成片段化cRNA。片段化的cRNA加入120ul雜交液混合后注入雜交條的樣品孔內(nèi)，安裝好芯片條，置于45℃雜交儀中，雜交過夜。雜交結(jié)束后，將芯片條置于流體工作站進(jìn)行自動(dòng)化洗滌和染色步驟。自動(dòng)清洗染色結(jié)束后，再將芯片條放入掃描儀中，關(guān)好艙門，進(jìn)行芯片掃描。

1.4 篩選共同差異基因掃描結(jié)束后，GeneAtlas芯片分析系統(tǒng)的芯片分析功能對(duì)芯片雜交圖像進(jìn)行自動(dòng)分析，獲得基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值（表達(dá)豐度值），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。然后采用SAM(Significant Analysis of Microarray)軟件倍數(shù)差異法，以2倍或以上（Ratio≥2 或≤0.5）差異為標(biāo)準(zhǔn)來篩選非浸潤性BTCC與正常膀胱黏膜上皮的差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果

2.1總RNA抽提質(zhì)檢結(jié)果經(jīng)測定，所有組織標(biāo)本抽提的總RNA的A 260/280比值介于1.99-2.08， RNA樣品平均濃度>60 ug/ul；RNA電泳條帶清晰， 28S無明顯降解，28S：18S rRNA條帶亮度接近或略小于2：1，證實(shí)總RNA樣品質(zhì)量合格，符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求。

2.2共同差異基因篩選結(jié)果采用SAM3.0軟件對(duì)掃描后獲得的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以Fold change≥2.0或≤0.5為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，3對(duì)標(biāo)本共篩選出274個(gè)共同差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因97個(gè)，表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有178個(gè)。表達(dá)顯著增高的基因有AI970337、NM_181799.1、AY217347.1、NM_001080430.2、NM_024762.3等，表達(dá)顯著下調(diào)的基因有BC057807.1、NM_001299.4、BC039893.1、N52335、D00137.1等。

3討論

膀胱細(xì)胞癌變始于細(xì)胞DNA改變。癌基因突變、抑癌基因失活，細(xì)胞生長、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡機(jī)制異常等導(dǎo)致膀胱癌發(fā)生和進(jìn)展。p53、FGFR3癌基因突變，被認(rèn)為是膀胱癌發(fā)生兩大通路關(guān)鍵因素[2]，Survivin、EGFR過表達(dá)對(duì)腫瘤侵襲、進(jìn)展有一定關(guān)系[3，4]?；蛐酒夹g(shù)以其高通量、大規(guī)模、高效等優(yōu)點(diǎn)，可以從全基因組水平研究膀胱癌基因表達(dá)譜差異， 揭示膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，并進(jìn)一步發(fā)掘早期診斷以及復(fù)發(fā)監(jiān)測新型腫瘤標(biāo)記基因。Guo等應(yīng)用cDNA基因芯片技術(shù)和抑制消減雜交技術(shù)對(duì)膀胱癌尿脫落細(xì)胞表達(dá)譜進(jìn)行檢測，建立了可靠地差異基因表達(dá)文庫，并驗(yàn)證端粒酶、HOXA13、IGF-1與膀胱腫瘤相關(guān)基因。

本實(shí)驗(yàn)采用可檢測約20，000個(gè)功能確定、有完整注釋基因的36，000個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)譜芯片，檢測非浸潤性BTCC和正常膀胱黏膜上皮中基因表達(dá)譜。結(jié)果顯示，3 例標(biāo)本中篩選共同差異表達(dá)基因274條，其中表達(dá)上調(diào)96 條，表達(dá)下調(diào)178條。這些差異基因按其功能主要可以分為以下幾類：原癌基因和抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、細(xì)胞粘附、免疫相關(guān)基因、細(xì)胞受體、離子結(jié)合蛋白、細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白以及一些未知功能基因?；贙EGG數(shù)據(jù)庫，上調(diào)的96個(gè)基因中，涉及已知的42 條信號(hào)通路，下調(diào)的178 個(gè)基因，涉及已知的63 條信號(hào)通路，其中包括已知直接與膀胱癌相關(guān)或與腫瘤發(fā)生相關(guān)的通路， 如p53 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞周期通路、細(xì)胞凋亡通路、ECM-受體相互作用通路、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解通路、Ras 通路、JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、FGFR 信號(hào)通路等。這充分證明非浸潤性BTCC的發(fā)生是一個(gè)多基因改變，涉及多條通路調(diào)控的復(fù)雜過程，進(jìn)一步深入研究并這些膀胱癌標(biāo)志基因及其涉及的信號(hào)通路，可以對(duì)非浸潤性BTCC發(fā)生機(jī)制闡明提供可信的依據(jù)。

綜上所述， 膀胱癌是多基因改變，涉及多條信號(hào)通路調(diào)控異常， 從而導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的結(jié)果。通過高通量基因芯片對(duì)膀胱癌基因表達(dá)變化的研究， 高效、系統(tǒng)、大規(guī)模地獲取生物內(nèi)在信息， 可以更好的理解膀胱癌分子機(jī)制， 為膀胱癌預(yù)防、診斷及基因靶向治療等方面提供新的思路和方法。

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編輯/王海靜