摘要：目的探討2種哮喘相關(guān)基因位點(diǎn)在哮喘患兒中的單核苷酸多態(tài)性多態(tài)性位點(diǎn)與哮喘易感性關(guān)系。方法采用熒光定量PCR及測序技術(shù)檢測2種哮喘相關(guān)基因位點(diǎn)在153例過敏性哮喘患兒和120例健康對照者中的分布。結(jié)果MSA2基因和TNF-α基因在哮喘組與健康對照組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論MS4A2基因和TNF-α基因可能不是兒童過敏性哮喘的危險因素，可能與兒童過敏性哮喘無關(guān)。

關(guān)鍵詞：哮喘；單核苷酸多態(tài)性；遺傳易患性；兒童

支氣管哮喘是兒童呼吸系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢， 給兒童健康造成嚴(yán)重危害，且部分兒童哮喘可遷延至成人哮喘，成為終生疾患。因此，對哮喘的合理防治至關(guān)重要。近年來隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的不斷發(fā)展， 對哮喘基因的研究日漸深入，目前公認(rèn)哮喘具有明顯家族聚集傾向， 是一種復(fù)雜的多因子、多基因遺傳病。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1哮喘組 選取2010年02月18日~2014年2月15日在鄭大三附院診斷為支氣管哮喘的0.5～14歲患兒153例為哮喘組，平均年齡8.7歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組2008年修定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[1]。兩組兒童在年齡、性別方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

1.1.2正常對照組 收集同期與病例組基本資料相近且無身心相關(guān)疾病的健康兒童120例為對照組，除個人和或三代以內(nèi)直系親屬中家族特應(yīng)性疾?。òㄌ貞?yīng)性皮炎、過敏性鼻炎、哮喘）病史，近1個月無呼吸道感染史，平均年齡8歲。

1.2方法 利用TaqMan-MGB技術(shù)進(jìn)行小兒哮喘易患基因SNP位點(diǎn)的基因分型，用SNP檢測方法采集兒童的口腔黏膜上皮脫落細(xì)胞，進(jìn)行DNA提取并對MS4 A2基因Glu237Gly及腫瘤壞死因子-α( TNF-α) 基因G-308A 2種哮喘相關(guān)基因位點(diǎn)的SNP進(jìn)行檢測。

1.2.1口腔黏膜細(xì)胞DNA抽提 采集標(biāo)本前入組兒童禁食半小時。使用特殊口腔刷反復(fù)刮拭頰內(nèi)側(cè)粘膜約20次，將特殊口腔刷置入2 mL離心管中。收到口腔拭子采集管后加入400 uL溶液Ⅰ，放置30 min，按流程提取DNA片段。

1.2.2 TaqMan探針法進(jìn)行SNP 分析

1.2.2.1 Taqman-MGB探針法所用引物和探針均包含于Applied Biosystems公司設(shè)計并合成的TaqMan○R SNP Genotyping Assay Mix。反應(yīng)在ABI9700 PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，然后再ABI7900實(shí)時光定量PCR儀中進(jìn)行終點(diǎn)讀板。反應(yīng)結(jié)果由ABI SDS2.3軟件判斷得出基因型。

1.2.2.2通過比較和分析哮喘患兒和正常兒童這些位點(diǎn)的差異，能準(zhǔn)確地反映我國漢族人群哮喘易患性的SNP組合并將其開發(fā)成分子診斷試劑盒，用以對兒童是否易患哮喘進(jìn)行科學(xué)地預(yù)測和篩查。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，計數(shù)資料采用頻數(shù)表示?；蛐筒捎弥苯佑嫈?shù)法，等位基因數(shù)=該基因純合子數(shù)×2+該基因雜合子數(shù)，且等位基因確認(rèn)符合Hardy-Weinberg平衡；哮喘組和對照組間基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2種哮喘相關(guān)基因位點(diǎn)(MS4 A2基因Glu237Gly；TNF-α基因G-308A)在各組中的差異未見有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

3討論

哮喘是由多個基因和環(huán)境因子相互作用的復(fù)雜疾病。多種基因可能分別或共同控制與哮喘有關(guān)特征性表型的表達(dá)。Ober等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在6個或更多的獨(dú)立樣本中得以重復(fù)的25個基因與哮喘或變應(yīng)性疾病表型相關(guān)，是真正的哮喘或變應(yīng)性疾病易患基因，我們選擇了目前2個國內(nèi)外較為肯定的哮喘相關(guān)基因位點(diǎn)： MS4 A2 基因Glu237Gly及TNF-α基因G-308A。

跨膜結(jié)構(gòu)域4亞家族A，成員2（MS4A2）是一異型多聚復(fù)合物，其最主要功能是參與IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)。過敏性哮喘相關(guān)的兩種細(xì)胞：巨細(xì)胞及噬堿性白血球，都有MS4A2基因產(chǎn)生的接受器，過敏原與MS4A2結(jié)合后，會啟動急性高敏反應(yīng)。FcER I基因定位于11號染色體， 由ABC2 組成。其中A鏈為IgE 結(jié)合單位。C鏈有一跨膜區(qū)。B鏈為信號放大器，有四個跨膜區(qū)， N 端和C 端均在胞漿，C端有ITAM樣結(jié)構(gòu)， 可提高信號傳遞速度的5-7倍[3]。FcERIB基因的E237G突變指的是該編碼區(qū)第7外顯子處6843位點(diǎn)堿基由鳥嘌呤(G) 取代腺嘌呤(A)， 導(dǎo)致B鏈氨基酸系列中胞漿區(qū)羧基末端237位氨基酸由甘氨酸(Gly) 代替了谷氨酸(Glu)。Gly237取代Glu237可能活化B鏈表達(dá)， 從而進(jìn)一步促進(jìn)IgE合成[4]。趙凱姝等[5]報道，MS4A2 Glu237Gly點(diǎn)突變與小兒哮喘無關(guān)，陳虹等[6]通過對122例哮喘患兒237G位點(diǎn)的基因型以及等位基因頻率與正常對照組相比研究， 未能獲得足夠證據(jù)證實(shí)該基因是哮喘易感性及特應(yīng)性進(jìn)而導(dǎo)致血清總IgE水平增高的決定性基因。

TNF-α基因存在多個多態(tài)位點(diǎn)， WilsonAG[7]等人首先發(fā)現(xiàn)了TNF-α基因啟動子區(qū)域內(nèi)-308位點(diǎn)的雙等位基因多態(tài)性，TNF-α在啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游第308位點(diǎn)，由腺嘌呤核苷酸A替代了鳥嘌呤核苷酸G，G存在的基因成為TNF-1，A替代的基因稱為TNF2，目前存在三種基因型：AA（突變純合子），AG（突變雜合子），GG（無突變）。近年來有關(guān)TNF-α基因多態(tài)性與支氣管哮喘的關(guān)系已有很多研究，但機(jī)制尚未完全明了。翟芳芝等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α-308A 等位基因頻率在哮喘組和對照組中有顯著差異；WINCHESTER研究了腫瘤壞死因子-308G-A 變異和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因插入/ 缺失變異的2 組哮喘兒童，發(fā)現(xiàn)-308A 等位基因頻率在南亞人群中無明顯改變。

本研究結(jié)果顯示，哮喘組MS4A2基因及TNF-α基因等位各等位基因頻率與健康對照組無明顯差異，提示MS4A2基因TNF-α基因可能非河南地區(qū)兒童哮喘的易感基因。

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