摘要：目的探討PCR-RFLP技術(shù)判斷IL-6基因啟動子區(qū)-634C/G多態(tài)性的最適實(shí)驗(yàn)條件。方法對影響PCR的部分因素和影響RFLP方法的一些因素進(jìn)行研究。結(jié)果PCR擴(kuò)增IL-6基因啟動子區(qū)的最適條件為：引物濃度為30umol/L；Taq酶量為5U； dNTP濃度為56μmol／L。最經(jīng)濟(jì)有效的酶切體系為20μl體系中加4μl產(chǎn)物用5U的酶消化9h。結(jié)論最佳的實(shí)驗(yàn)條件的探索是進(jìn)行大批量實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵。

關(guān)鍵詞：白細(xì)胞介素-6基因；多態(tài)性；聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性；試驗(yàn)條件糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者一種常見的嚴(yán)重的致盲眼病。DR也是DM常見且難治的并發(fā)癥之一，在歐美各國四大致盲眼病中占第一或第二位， 在我國也是主要致盲病之一，約10%DM患者在起病后5～9年便可發(fā)生DR，15 年后約50 %的人發(fā)生DR，25 年后80 %～90 %的人發(fā)生DR[1]。DR的發(fā)病機(jī)制是環(huán)境和遺傳因素共同作用的。長期的高血糖是最重要的原因，然而，DR的發(fā)生發(fā)展不同的個體差異很大，這也說明遺傳可能起一定作用。近年來提出T2DM是一種亞臨床炎癥性疾病，作為炎癥反應(yīng)的核心細(xì)胞因子IL-6，張潔等[2]研究發(fā)現(xiàn)隨著糖尿病視網(wǎng)膜病變程度的加重，淚液IL-6含量逐漸升高，提示淚液IL- 6水平與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生有關(guān)。體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞顯示：糖化蛋白終末產(chǎn)物可引起視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，并且存在劑量依賴關(guān)系，IL-6的增加與DR的發(fā)生密切相關(guān)[3]。我們就此多態(tài)性進(jìn)行檢測，旨在探討L-6基因啟動子區(qū)-634C/G多態(tài)性與中國廣東地區(qū)漢族人DR是否存在關(guān)聯(lián)。限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)中研究基因變異的一把手術(shù)刀，可以特異性切割所識別的堿基序列，利用這個特點(diǎn)，可以用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測基因片段中某一位點(diǎn)是否存在變異。L-6基因啟動子區(qū)634位點(diǎn)對應(yīng)限制性內(nèi)切酶BsrBI（MbiI）的酶切位點(diǎn)，酶切后有三種情況：①酶切后PCR產(chǎn)物長度無變化，為CC基因型；②雜合型，電泳圖譜出現(xiàn)三條帶，即為CG基因型；③PCR產(chǎn)物被切開，為純合型，即為GG基因型。盡管PCR和酶切是兩種比較成熟的技術(shù)，但對于不同的模板和引物而言，所需的PCR反應(yīng)條件是不同的。但如果實(shí)驗(yàn)條件把握不準(zhǔn)確，可造成假陰性或假陽性結(jié)果，因此有必要對實(shí)驗(yàn)條件加以研究，以得出最適條件，進(jìn)而才能得出準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。本文為確定PCR-RFLP方法檢測L-6基因啟動子區(qū)-634C/G多態(tài)性的最適實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)而研究其與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系，對影響PCR反應(yīng)以及內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化研究。

1資料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料主要儀器：BIO-RAD S1000基因擴(kuò)增儀；Power Pac 3000型電泳儀和Gel Doc1000紫外圖像分析系統(tǒng)和配套的分析軟件（美國BIO-RAD公司）；5417R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；恒溫和可控水浴箱（上海醫(yī)療器械廠）。

主要試劑：合成引物（北京市理化分析測試中心合成）：上游引物：5’-GAGACGCCTTGA AGTAACTG-3’，下游引物5’-AACCAAAGATGTTCTGAAC

TGA-3’。 5U/μl的TaqDNA聚合酶、100mmo1/L的dNTP和限制性內(nèi)切酶BanII均購于寶生物（大連）有限公司；DNA分子量標(biāo)記（Marker）購于天根生化科技（北京）有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1．2方法模板DNA的抽提：選用QIAamp DNA Mini kit試劑盒按說明書提取模板DNA，加入100 mL TE緩沖液，65℃水浴15~20min至DNA沉淀物質(zhì)完全溶解，儲存于4℃冰箱備用。

PCR擴(kuò)增：首先建立PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）擴(kuò)增目的DNA的實(shí)驗(yàn)條件?；痉磻?yīng)體系中模板1μL，10×緩沖液5μL，加去離子水至501μL條件不變，分別變化Taq酶量和dNTP、引物的濃度，按94℃預(yù)變性5min，后94℃45s，60℃45s，72℃1min進(jìn)行30個循環(huán)， 最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測均用瓊脂糖凝膠電泳法檢測：制備2%的瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴乙錠），將擴(kuò)增產(chǎn)物10μL與溴酚藍(lán)加樣緩沖液2μL混勻后和一份5μL MarKer同時(shí)加樣，在100V電壓條件下電泳30min，電泳結(jié)束后在Gel Doc1000紫外檢測系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

BsrBI限制性內(nèi)切酶的酶解:IL-6基因啟動子區(qū)-634位點(diǎn)變異純合子GG可以被此內(nèi)切酶完全切開呈兩條片段(分別為120bp和60bp)，野生純合子CC不被內(nèi)切酶切開呈一條片段(180bp)，而雜合子CG則部分被內(nèi)切酶切開呈三條片段(180bp、120bp和60bp)。首先采用過度酶量消化的方法(20μl反應(yīng)體系中內(nèi)切酶為10U，擴(kuò)增產(chǎn)物量為5μL，過夜酶切)找出一能被完全切開的野生純合子GG的DNA。然后使反應(yīng)體系中10×緩沖液2μL (含BSA)加去離子水至總體積20μL不變，按一定梯度設(shè)定酶切所用擴(kuò)增產(chǎn)物量、內(nèi)切酶的濃度、酶切時(shí)間。酶切后產(chǎn)物的檢測也采用瓊脂糖凝膠電泳法，制備2％瓊脂糖凝膠(含0．5μg／mL的溴乙錠)，將酶解產(chǎn)物10μL與溴酚藍(lán)加樣緩沖液2μL混勻后和一份5μLMarker同時(shí)加樣，在80V電壓下電泳45min，電泳結(jié)束后在Gel Doc 1000紫外檢測系統(tǒng)中觀察酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

2結(jié)果

2.1 PCR實(shí)驗(yàn)條件其它擴(kuò)增條件不變的情況下設(shè)定系列Taq酶量2.5~15U之間，如圖1所示。結(jié)果表明，均可以擴(kuò)增出目的DNA，2.5uTaq酶量產(chǎn)物量較少，其他產(chǎn)物量之間并無顯著性差異。為了使以后擴(kuò)增更加有效，并且節(jié)省酶量，選擇Taq酶量為5.0U。

圖l Taq酶量對PCR的影響

注：M為D2000的DNA分子量標(biāo)記，依次為100 250 500 750 1000 2000bp

1～6分別為2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 以及15u的Taq酶量。

其它擴(kuò)增條件不變的情況下設(shè)定系列引物濃度，范圍設(shè)計(jì)在：10～100pmol/ul的濃度之間，如圖2所示。結(jié)果表明，均有產(chǎn)物擴(kuò)出，但隨著引物濃度增加，引物二聚體也逐漸增加，產(chǎn)物量并不增加，選擇引物二聚體較少而產(chǎn)物量高的引物濃度30pmol/ul為最佳濃度。

圖2引物濃度對PCR的影響

注：M為D2000的DNA分子量標(biāo)記，依次為100 250 500 750 1000 2000bp；1～6分別為10、20、30、40、50以及100umol/L的引物濃度。

其它擴(kuò)增條件不變的情況下設(shè)定系列dNTP濃度，范圍設(shè)計(jì)在28~168μmol／L，如圖3所示。結(jié)果表明：產(chǎn)物量隨dNTP濃度的增加而有所增加，但在56μmol／L后產(chǎn)物量并無變化，選擇其最適dNTP濃度為56μmol／L。

圖3 dNTP濃度對PCR擴(kuò)增的影響

注：M為D2000的DNA分子量標(biāo)記，依次為100 250 500 750 10002000bp；1～6：28、56、84、112、140和168μmol/L的dNTP濃度。

2.2 BsrBI內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)條件酶切反應(yīng)體積:雖然一般試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)酶切體系為50μl，但結(jié)合眾多文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)驗(yàn)，50μl的反應(yīng)體積所需的擴(kuò)增產(chǎn)物量以及內(nèi)切酶的量均過大，不適宜進(jìn)行大量的酶切，而且RFLP只需要酶切后電泳檢測得出酶切圖譜，無后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要，因此設(shè)定反應(yīng)體積為20μl，在此基礎(chǔ)上確定酶量和擴(kuò)增產(chǎn)物量。

確定酶切所用的擴(kuò)增產(chǎn)物量:選擇一個能被完全切開而擴(kuò)增產(chǎn)物量多的模板，用擴(kuò)增產(chǎn)物2～8μl進(jìn)行酶切，酶足夠量(10U)、酶切時(shí)間延長至過夜，如圖5所示。結(jié)果表明：2、4、6、8μl時(shí)均可被切開，6、8μl的PCR產(chǎn)物酶切后有極少量的未被切干凈的痕跡，但不影響判斷基因型。2μl電泳結(jié)果分辨不清晰，而4μl時(shí)結(jié)果清晰可辨。為保證能夠酶切完全并且防止過多的擴(kuò)增產(chǎn)物對內(nèi)切酶的抑制，選擇4μl為最佳酶切產(chǎn)物量。

圖4擴(kuò)增產(chǎn)物量對酶切的影響

注：M為100bp遞增的DNA分子量標(biāo)記；1～4：2、4、6、8μl的擴(kuò)增產(chǎn)物。

確定酶切的酶量:加入已經(jīng)確定的擴(kuò)增產(chǎn)物量，將內(nèi)切酶的量設(shè)計(jì)為2.5U～10U四個梯度，酶切時(shí)間足夠(過夜)，如圖6所示。結(jié)果表明：2.5U、5U、7 U、和10U時(shí)沒有明顯差異，均呈現(xiàn)清晰的120bp一條片段（因?yàn)?0bp片段看不到），說明2.5U的酶量足以完全切開4μl的擴(kuò)增產(chǎn)物，2.5U內(nèi)切酶為最合適的酶量。

圖5內(nèi)切酶量對酶切的影響

注：M為100bp遞增的DNA分子量標(biāo)記；1—4：2.5U、5U、7.5U、10U的BsrBI內(nèi)切酶量。

確定酶切時(shí)間:酶切反應(yīng)體系相同，即各加入確定的擴(kuò)增產(chǎn)物量、內(nèi)切酶量，酶切時(shí)間設(shè)置為1～24h，如圖7所示。結(jié)果表明：1、3、5、7、9h酶切在原180bp處均有少量痕跡，而9h以后痕跡不明顯，不影響分辨，而且隨酶切時(shí)間延長并未發(fā)現(xiàn)非特異性切割，所以選擇過夜切割(超過9小時(shí))為最佳酶切時(shí)間。

圖6酶切時(shí)間的確定

注：M為100bp遞增的DNA分子量標(biāo)記：1～6分別為酶切1、3、5、7、9和24h

3討論

PCR-RFLP方法是檢測DNA片段是否存在已知位點(diǎn)變異的常用方法，但由于內(nèi)切酶和切割片段長度的不同，所要求的實(shí)驗(yàn)條件各異，由于實(shí)驗(yàn)條件涉及的因素較多，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，所以探索出一套最合適的實(shí)驗(yàn)條件是以后大批量實(shí)驗(yàn)的保證。

由于PCR后的產(chǎn)物要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，所以要求PCR的產(chǎn)物量要足夠酶切后的檢測，而且特異性要高，無非特異性擴(kuò)增，影響分辨的引物二聚體較少，所以此種實(shí)驗(yàn)方法的首要一環(huán)是擴(kuò)增出足以能夠進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化而能準(zhǔn)確檢測到的目的DNA片段。PCR擴(kuò)增所涉及的實(shí)驗(yàn)條件很多，包括引物濃度、dNTP濃度、Taq酶的用量、鎂離子濃度、熱循環(huán)的次數(shù)以及溫度、模板的量等。結(jié)合眾多文獻(xiàn)以及前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本文只對擴(kuò)增時(shí)對產(chǎn)物的特異性及產(chǎn)量影響較大的Taq酶量、引物濃度、以及dNTP濃度等主要實(shí)驗(yàn)影響因素進(jìn)行了優(yōu)化研究。

Taq酶量：不同來源和不同批次的Taq酶因其活性有不同程度的變化，可導(dǎo)致擴(kuò)增效率發(fā)生明顯改變。因此，同一研究中最好使用同一批次的Taq酶。通過實(shí)驗(yàn)得出每個反應(yīng)管所需Taq酶的酶量，在能檢查到足夠擴(kuò)增產(chǎn)物的情況下盡量用低濃度的酶，以降低檢測成本。

引物濃度：引物濃度不足，PCR效率極低，而過高的引物濃度又會引起模板與引物的錯配，PCR反應(yīng)特異性下降，同時(shí)形成引物二聚體的幾率增大[4]，產(chǎn)生大量的引物二聚體。

dNTP的濃度：標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中包含4種等摩爾濃度的dNTP，任何一種濃度明顯不同于其他幾種時(shí)，會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入，降低新鏈合成速度[5]。濃度過低，會降低反應(yīng)產(chǎn)量，高濃度的dNTP對擴(kuò)增反應(yīng)起抑制作用，也許是因?yàn)閐NTP與Mg2+螯合而引起的反應(yīng)。

內(nèi)切酶量以及酶切所用擴(kuò)增產(chǎn)物量：這兩種條件是密不可分的，進(jìn)行酶切的過程中，酶的用量過多會造成浪費(fèi)，而且內(nèi)切酶貯存液中內(nèi)含有甘油，當(dāng)內(nèi)切酶量過多使甘油濃度超過5％時(shí)可抑制內(nèi)切酶活性，而內(nèi)切酶量過少會導(dǎo)致切不開或切不完全。同理，酶切時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物量過多也會造成酶量的相對不足，甚至?xí)?nèi)切酶產(chǎn)生抑制作用，此外，DNA溶解于TE緩沖液，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物量超過整個酶切體積的1／4時(shí)會對內(nèi)切酶產(chǎn)生抑制作用，而過少會導(dǎo)致電泳后檢測時(shí)的片段不清。擴(kuò)增產(chǎn)物量雖然可以通過分光光度計(jì)法以及溴化乙錠熒光定量法測得濃度，但實(shí)際應(yīng)用時(shí)仍需要經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定酶切時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物量。

酶切時(shí)間：雖然試劑盒上有參考的酶切時(shí)間，但隨著其它實(shí)驗(yàn)條件的變化，也須重新確定，因?yàn)槊盖袝r(shí)間過長使酶活性喪失，并不會因?yàn)闀r(shí)間的延長而減少內(nèi)切酶的用量，甚至?xí)斐蓛?nèi)切酶星號活性(在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下切割與內(nèi)切酶識別順序相似的序列)的發(fā)生[6]，時(shí)間過短又會使內(nèi)切酶的作用未發(fā)揮完全。電泳時(shí)間必須適度而且一致，時(shí)間過長會造成條帶模糊不清，甚至DNA從凝膠中泳出，過短會造成片段分不開，每次電泳時(shí)間不一致會造成橫向無法比較。

這些實(shí)驗(yàn)條件之間互相關(guān)聯(lián)、互相影響，如導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物切不完全的原因可能是內(nèi)切酶的用量不足，也可能是酶切時(shí)間過短，還可能是酶切體系中擴(kuò)增產(chǎn)物量過多而對內(nèi)切酶產(chǎn)生了抑制作用。所以，必須在大批實(shí)驗(yàn)前確定實(shí)驗(yàn)條件。當(dāng)然，限制性內(nèi)切酶的緩沖液構(gòu)成和酶切溫度也是影響內(nèi)切酶消化的重要因素，但現(xiàn)在的內(nèi)切酶試劑盒均提供了適宜的緩沖液和酶切所需溫度，所以在此無需討論。

通過上述研究，確定了PCR擴(kuò)增L-6基因啟動子區(qū)進(jìn)而進(jìn)行內(nèi)切酶消化的各種最適實(shí)驗(yàn)條件，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

PCR擴(kuò)增L-6基因啟動子區(qū)的最適條件：最佳引物濃度為30umol /L；最佳Taq酶量為5 U；最適dNTP濃度為56μmol／L；BsrBI酶切的最適條件：20μl的酶切體系中，最佳酶切產(chǎn)物為4μl，最佳內(nèi)切酶量為5U，酶切時(shí)間9h。以上參數(shù)偏離最適條件將會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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