摘要：目的 研究老年人群Klotho基因3個單核苷酸多態(tài)性以及該多態(tài)性與老年2型糖尿病的相關性。方法 選擇老年糖尿病患者315例、正常健康人群 383例作為研究對象。提取外周血白細胞基因組DNA，應用單一等位基因特異性引物PCR技術（SASP-PCR），檢測Klotho基因3個SNP位點的基因型。結果老年糖尿病組的Klotho基因G-395A SNP AA等位基因頻率較正常對照組顯著增高（P=0.002），按性別進行分層研究，無論男性還是女性糖尿病病組，G-395A SNP AA等位基因型頻率均較對照組增高，差異均具有顯著性（P值分別為P=0.026，P=0.022）。糖尿病組的Klotho C370S CC等位基因頻率較對照組增高，差異具有顯著性（P=0.005），按照性別進行分層研究，男性糖尿病組的Klotho C370S CC等位基因頻率較對照組明顯增高，差異有顯著性（P=0.000）。糖尿病組Klotho基因SNP F352V FF、FV及VV等位基因型頻率較對照組均無顯著性差異，按性別進行分層研究，無論男性還是女性糖尿病組，該等位基因型頻率較對照組也均無顯著性差異（P>0.05）。結論 本文研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因 G-395A SNP與老年糖尿病有相關性，并發(fā)現(xiàn)AA等位基因型攜帶者人群易患糖尿??；同時發(fā)現(xiàn)Klotho C370S CC的男性攜帶者易患糖尿病；尚未發(fā)現(xiàn)Klotho基因F352V SNP與老年糖尿病有相關性。

關鍵詞：Klotho基因；單核苷酸多態(tài)性；2型糖尿??；老年

Association of Single Nucleotide Polymorphism of Human Klotho Gene with Type 2 Senile Diabetes Patients

ZHOU Ting，LIU Xiao-lin，TIAN Xiao-chun，WU Ping，MA Hou-xun

(Department of Geriatrics，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the three single nucleotide polymorphisms of Klotho gene in old people and the association between them and senile type 2 diabetes patients. Methods315 patients with senile diabetes and 383 healthy person are enrolled in the study ，extraction the DNA of peripheral blood leucocyte ，detect gene types of the three single nucleotide polymorphisms loci of Klotho gene with single allele specific primer PCR.Results1.allele AA frequency of the klotho gene G-395A SNP in patients with diabetes were significantly higher compared with healthy control(P=0.002)；stratified by gender， allele AA frequency of the klotho gene G-395A SNP were significantly higher in both males and females diabetes patients than healthy control(P=0.026 and 0.022).2. allele CC frequency of the klotho gene G-370S SNP in patients with diabetes were significantly higher compared with healthy control(P=0.005)， stratified by gender， allele CC frequency of the klotho gene G-370S SNP were significantly higher in males diabetes patients than healthy control (P=0.000). 3.No significant difference was found between diabetes patient andhealthy control in the frequency of allele FF 、FV、 VV ofSNP F352V.No significant difference was found between diabetes patients and healthy people either when stratified by gender.Conclusion1. klotho gene G-395A SNP is related with senile diabetes， people with allele AA of G-395A are liable to diabetes . 2.Male patients with allele CC of G-370S are also liable to diabetes.3.klotho gene F352V is not related with senile diabetes.

Key words：Klotho gene;Single nucleotide polymorphism;Type 2 diabetes;Senile隨著人口高齡化程度日益加劇，老年糖尿病患者人群明顯增加，糖尿病已成為影響老年人群生命健康的重要疾病之一。目前研究證實，Klotho（克老素KL）基因是一種與衰老發(fā)生密切相關的基因[1]。 Bartke A等[2]研究發(fā)現(xiàn)，過表達KL基因的小鼠，壽命明顯延長，其機制與Klotho誘導IGF-1合成及胰島素抵抗有關，這就提示糖尿病的發(fā)生、發(fā)展可能與Klotho基因的生物學功能有關。為此，本文通過研究Klotho基因G-395A、F352V與C370S單核苷酸多態(tài)性（SNP），以及其與老年糖尿病相關性，以求為糖尿病早期干預研究提供線索。

1資料與方法

1.1一般資料研究對象來自于重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院老年病科（門診及住院）在2007年2月~2009年5月收治的患者，其中符合1999年WHO糖尿病診斷標準的333例老年糖尿病個體作為研究組，其中男性206例，女性127例，平均年齡（72.70±7.94）歲，同時隨機選擇同期321名符合正常健康人群標準的健康個體作為老年對照組，其中男性196，女性125例，平均年齡（67.25±6.74）歲。詳細采集記錄包括年齡、性別、血壓、身高、體重、血液生化指標在內(nèi)的相關資料。所有研究對象均被告知本研究目的，并簽署知情同意書。其中正常對照組入選標準為：①血壓<140/90mmHg；②無心、腦、肺、腎、肝、膽、糖尿病及腫瘤病史；③心電圖、尿常規(guī)、肝、腎功能、血糖、血脂登實驗室檢查正常。

1.2方法

1.2.1 DNA提取取外周靜脈血2ml，EDTA抗凝，使用上海華舜生物工程有限公司提供的人類血液基因組DNA抽提試劑盒抽提外周血白細胞基因組DNA，操作方法按試劑盒說明進行。

1.2.2 KL G-395A、F352V與C370S基因多態(tài)性檢測方法

1.2.2.1 KL G-395A、F352V與C370S基因多態(tài)性檢測引物Klotho的基因序列及相應位點的SNP信息均參照NCBI，利用Primer5.0軟件設計等位基因特異性引物，設計方法參見文獻[4-6]，具體設計引物序列見表1。所有引物合成操作均由中國大連寶生物技術有限公司（TaKaRa）完成。

1.2.2.2 KL G-395A、F352V與C370S基因多態(tài)性檢測方法Klotho G-395A SNP檢測：PCR反應體系及反應條件，參照文獻[4-6]進行。取PCR產(chǎn)物5ul，使用瓊脂糖凝膠-溴化乙錠染色法電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并判斷其結果。klotho基因G-395A多態(tài)性等位基因型為GG、GA、AA3種形式；其PCR擴增產(chǎn)物片段長度為147bps。

Klotho F352V SNP檢測：PCR反應體系及反應條件，參照文獻[4-6]進行。取PCR產(chǎn)物5ul，使用瓊脂糖凝膠-溴化乙錠染色法電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并判斷其結果。klotho基因F-352V多態(tài)性等位基因型為FF、FV、VV3種；其PCR擴增產(chǎn)物片段長度為230bps。

Klotho C-370S SNP檢測： PCR反應體系及反應條件，參照文獻[4-6]進行。取PCR產(chǎn)物5ul，使用瓊脂糖凝膠-溴化乙錠染色法電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并判斷其結果。klotho基因C370S多態(tài)性等位基因型為CC、CS、SS3種；其PCR擴增產(chǎn)物片段長度為285bps。

1.2.3生化指標檢測 實驗組和對照組均同時檢測血清生化指標，包括總膽固醇（TC），甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白(HDL-C)，低密度脂蛋白(LDL-C)，空腹血糖及餐后2h血糖等。所有生化指標檢測均統(tǒng)一由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗科實驗室完成，以確保檢驗結果質(zhì)量準確可靠。

1.3統(tǒng)計分析分析采用SPSS18.0軟件，定性指標采用各組中所占的百分數(shù)表示，使用χ2檢驗進行分析。定量指標經(jīng)正態(tài)檢驗后使用t檢驗，各項指標以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1老年糖尿病組與對照組的基本情況老年糖尿病組與對照組基本資料對比結果顯示：老年糖尿病組相對對照組來說，年齡、體重指數(shù)、高血壓、血脂異常及冠心病均偏高，差異具有有顯著性（P<0.001），見表2。

2.2糖尿病組與對照組KL基因SNP各等位基因頻率分布對Klotho基因G-395A SNP AA等位基因來說，在老年糖尿病組中，該基因頻率較正常對照組明顯增高，差異具有顯著性（P=0.002）；按照性別進行分層研究，無論男性還是女性糖尿病亞組，Klotho基因G-395A SNP AA等位基因型頻率均較對照組有顯著性增高（P值分別為P=0.026；P=0.022）。另在老年糖尿病病組中，Klotho基因G-395A SNP GG等位基因頻率較對照組明顯降低，差異具有顯著性（P=0.007）；若按性別進行分層研究，糖尿病組中僅女性亞組的GG等位基因頻率較對照組減低，差異有顯著性（P=0.003）。見表3。

老年糖尿病組Klotho C370S CC等位基因頻率較對照組增高，差異有顯著性（P=0.005）；按性別進行分層研究，糖尿病組中僅男性亞組Klotho C370S CC等位基因頻率較對照組明顯增高，差異有顯著性（P=0.000）。老年糖尿病組Klotho基因SNP C370S CS等位基因頻率較對照組減低，差異有顯著性（P=0.005）；按性別分層研究，僅在男性糖尿病亞組Klotho基因SNP C370S CS等位基因頻率較對照男性亞組明顯減低，差異有顯著性（P=0.000）。見表3。

老年糖尿病組Klotho基因SNP F352V FF、FV及VV等位基因型頻率較對照組均無顯著性差異；按性別進行分層研究，無論男性還是女性糖尿病亞組其等位基因型頻率較對照亞組均無顯著性差異（P>0.05）。見表3。

3討論

老年人群中，糖尿病發(fā)病率明顯增加，已成為影響老年人群健康的重要疾病，其中 2型糖尿病為老年糖尿病的主類型，其發(fā)病機制主要與胰島素抵抗或胰島素敏感性降低等因素有關。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Klotho基因及其表達產(chǎn)物-klotho蛋白在胰島素、IGF-1信號通路中起到十分重要的調(diào)節(jié)作用，由此推測Klotho基因與糖尿病的發(fā)病可能有著密切的內(nèi)在相關性。動物實驗研究表明KL基因缺失的小鼠血糖和胰島素的水平降低，而其胰島素的敏感性增加[3，7]。新近研究[8，9]也發(fā)現(xiàn)klotho 在鈣平衡、糖代謝中發(fā)揮作用。而有關Klotho基因SNP與糖尿病之間的相關性研究報導甚少，為此，通過研究Klotho基因SNP單基因型及其基因型組合分布規(guī)律，以期闡述其與老年人群2型糖尿病的相關性，為老年人群糖尿病早期干預提供依據(jù)。

本文研究發(fā)現(xiàn)，老年糖尿病組中，Klotho基因G-395A SNP AA等位基因頻率較正常對照組高，其差異具有顯著性；按性別進行分層研究，無論男性還是女性糖尿病亞組人群，Klotho基因G-395A SNP AA等位基因頻率均較正常對照亞組顯著性高，即提示攜帶有G-395A SNP AA等位基因型的老年人群，其罹患糖尿病的風險高。另外，糖尿病病組Klotho基因G-395A SNP GG等位基因頻率較對照組降低，而在女性糖尿病亞組患者中其GG等位基因型頻率較對照組亦降低，則提示對于老年女性人群，G-395A GG等位基因攜帶者罹患糖尿病的風險可能會下降。

糖尿病組Klotho C370SCC等位基因頻率較對照組高，同時，在男性糖尿病患者中 ，Klotho C370S CC等位基因頻率亦較對照組增高，這就提示攜帶CC等位基因的人群，尤其是男性人群發(fā)生糖尿病的幾率增高。另外，本文研究結果顯示糖尿病組Klotho基因SNP C370S CS等位基因頻率較對照降低，并發(fā)現(xiàn)在男性糖尿病亞組患者中Klotho C370S CS等位基因頻率較對照亦明顯減低，提示攜帶有CS等位基因的老年人群，尤其是男性人群不易患糖尿病。

本文研究還發(fā)現(xiàn)，糖尿病組Klotho基因SNP F352V FF、FV及VV等位基因型頻率較對照組均無顯著性差異，按性別進行分層研究，各性別亞組在糖尿病組及正常對照組之間均無統(tǒng)計學差異（P>0.05），提示Klotho 基因SNP F352V與糖尿病的發(fā)生可能無明顯相關性。國外學者Freathy等[10]研究也發(fā)現(xiàn)在英國高加索人群中，KL-VS功能性突變與其糖尿病也無明確相關性。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)G-395A AA等位基因型攜帶者易患糖尿病，提示Klotho基因 G-395A SNP與老年糖尿病有相關性；同時發(fā)現(xiàn)在Klotho基因SNP中 CC等位基因的男性攜帶者易患糖尿病，即提示Klotho基因SNP與糖尿病發(fā)病易感性有關，這就為人們開展針對糖尿病的易感性基因型篩檢研究提供新線索。但基于本組資料樣本偏小，其研究結論尚需進一步研究證實。

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編輯/哈濤