摘要：目的建立靈芝孢子粉中靈芝多糖、總?cè)圃碥盏暮繙y(cè)定方法。方法采用紫外分光光度法，苯酚-濃硫酸比色法于波長(zhǎng)492nm處測(cè)定靈芝多糖吸光度；以香草醛∶高氯酸∶冰乙酸（2∶8∶50）為顯色劑，于波長(zhǎng)555nm處測(cè)定總?cè)圃碥盏奈舛?。結(jié)果多糖、總?cè)圃碥盏臉?biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍分別為0.0100~0.0300mg（r=0.9982）；0.025~0.125mg（r=0.9996），多糖、總?cè)圃碥盏钠骄訕踊厥章史謩e為101.17%、100.74%，RSD分別為1.84%、1.29%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于靈芝孢子粉中多糖、總?cè)圃碥盏暮繙y(cè)定。

關(guān)鍵詞：靈芝孢子粉；靈芝多糖；總?cè)圃碥?；含量測(cè)定；紫外分光光度法

Determination of the Content of Different Origin of Ganoderma Lucidum Polysaccharide， Total Three Terpene Saponins

DENG Gui-qiu1，SU Zhen-ning2，ZHANG Jian-run2，WU Mao-yong2，WU Yi-na2

(1.The First People's Hospital of Baiyun District of Guangzhou City，Guangzhou 510405，Guangdong，China;2.School of Traditional Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 ，Guangdong，China)

Abstract：Objective To establish a method for content determination of total polysaccharides and triterpenoid saponin in the GLS.Methods UV Spectrophotometry，phenol-sulfuric acid;vanillin-glacial acetic acid-sulphuric acid-perchloric acid mixture at the wavelength of 492nm and 555nm absorbance.Results The linear range of total ginseng polysaccharides was 0.0100~0.0300mg(r=0.9982);0.025~0.125mg(r=0.9996).The recovery rate of the study was 101.17%、100.74%，RSD=1.84%、1.29%.Conclusion The results of simulation indicate that this method was accurate，reliable and reproducible.It was suggested that this method can be used to determine the content of total polysaccharides and triterpenoid saponin in the GLS.

Key words：GLS;Polysaccharides;Triterpenoid saponin;Determination;Ultraviolet spectrophotometry靈芝，為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝（Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst）、紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）的干燥子實(shí)體。靈芝孢子粉是靈芝在生長(zhǎng)成熟期，從靈芝菌褶中彈射出來的極其微小的卵形生殖細(xì)胞，主產(chǎn)于安徽大別山、浙江、山東、吉林，具有扶正固本、健脾和胃、補(bǔ)益精氣功能，能夠調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體免疫力和預(yù)防心腦血管病的作用，同時(shí)還有抗疲勞、美容美顏、延緩衰老與及預(yù)防艾滋病的功效[1，2]。靈芝孢子粉的主要有效成分為靈芝多糖和三萜類化合物，不同來源的樣品，其靈芝多糖和靈芝三萜皂苷含量存在較大差異[3，4]，本研究考察產(chǎn)區(qū)的靈芝孢子粉的多糖及三萜皂苷含量，建立靈芝孢子粉中靈芝多糖、總?cè)圃碥蘸繙y(cè)定的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、快速，為靈芝的深入研究及質(zhì)量控制提供了更加可靠的方法。

1儀器與試藥

1.1儀器紫外可見分光光度計(jì)（Bluestar A北京萊伯泰科儀器有限公司）；分析天平（Sartorius BP211D北京賽多利斯天平有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SH-B鞏義市儀器有限責(zé)任公司）。

1.2試藥無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：GCS137，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；皂苷對(duì)照品（批號(hào)：11041201，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；靈芝孢子粉（批號(hào)：20110920，分別采購(gòu)于江蘇大豐、吉林長(zhǎng)春、山東濟(jì)寧、山東春江、安徽亳州、安徽金寨、安徽霍山一品堂）；苯酚（批號(hào)：20100715，天津諾克科技發(fā)展有限公司）；濃硫酸（批號(hào)：20110701，廣州化學(xué)試劑二廠）；香草醛（批號(hào)：20100315，天津市百世化工有限公司）；高氯酸（批號(hào)：20100904，天津市百世化工有限公司）；冰醋酸（批號(hào)：20090320，天津市百世化工有限公司）；乙醇（批號(hào)：20100806，天津市百世化工有限公司），以上試劑均為分析純。

2結(jié)果

2.1葡萄糖對(duì)照品溶液的制備與多糖的供試品溶液的制備對(duì)照品溶液的制備：取無水葡萄糖對(duì)照品約0.01g，精密稱定，置100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1mg/mL的對(duì)照品貯備液。

供試品溶液的制備：取靈芝粉末0.5g，精密稱定，置索氏提取器中，加水90ml，電加熱器加熱回流提取5h，提取液轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密吸取50ml濃縮至約10ml，加入乙醇150ml，搖勻，4℃放置12h，取出，離心，傾出上清液，沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至250ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得[5]。

2.2三萜皂苷對(duì)照品溶液與總?cè)圃碥展┰嚻啡芤旱闹苽鋵?duì)照品溶液的制備：取干燥的皂苷對(duì)照品6mg，精密稱定，置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得皂苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密移取儲(chǔ)備液2~10mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得濃度為0.2412mg/mL的三萜皂苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取靈芝孢子粉粉末約0.5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，用50mL三氯甲烷，超聲30min，冷凝回流1.5h，濾過，揮干溶劑，用甲醇溶解置25mL量瓶中，定容，搖勻，即得三萜皂苷供試品溶液[6]。

2.3線性關(guān)系考察

2.3.1多糖的線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品溶液0.10mL，0.15mL，0.20mL，0.25mL，0.3mL分別置于10ml試管中，加入1.0mL的5%苯酚溶液，迅速加入7.0mL濃硫酸，加蒸餾水至刻度，振搖5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸餾水為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)492nm處測(cè)定各溶液吸光度。以對(duì)照品質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無水葡萄糖對(duì)照品在0.0100~0.0300mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9982，回歸方程為Y=0.3961X+0.1837。

2.3.2總?cè)圃碥盏木€性關(guān)系考察精密吸取三萜皂苷對(duì)照品溶液0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL分別置于試管中，水浴蒸干，加入5%的香草醛冰醋酸溶液0.2mL和0.8mL的高氯酸，在60℃下反應(yīng)15min，冰水冷卻，添加5mL冰醋酸，在波長(zhǎng)555nm處測(cè)定各溶液吸光度。以對(duì)照品質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三萜皂苷在0.025~0.125mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9996，回歸方程為Y=5.8089X+0.011。

2.4精密度試驗(yàn)

2.4.1多糖的精密度考察精密吸取無水葡萄糖對(duì)照品溶液1.5mL，按\"2.3.1\"項(xiàng)下顯色方法顯色，連續(xù)測(cè)定吸光度6次。結(jié)果顯示，精密度試驗(yàn)的RSD為1.42%（n=6），提示儀器精密度良好。

2.4.2總?cè)圃碥盏木芏瓤疾烊?biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下0.2495mg/mL三萜皂苷對(duì)照品溶液制備的樣品0.4mL，按\"2.3.2\"項(xiàng)下方法顯色，連續(xù)測(cè)定吸光度5次，求出RSD。結(jié)果顯示，精密度測(cè)定的RSD為1.40%（n=5），提示儀器精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.1多糖的穩(wěn)定性考察取藥材0.5g，精密稱定，按\"2.1\"項(xiàng)下的供試品制備方法制備溶液，精密量取該供試品溶液0.5mL，加入1.0mL的5%苯酚溶液，迅速加入7.0mL濃硫酸，加蒸餾水至刻度，振搖5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，在反應(yīng)后10min，15min，25min，35min，45min，60min，在波長(zhǎng)492nm下測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示：在60min內(nèi)6次測(cè)定值的RSD為0.26%（n=6），表明溶液在1h內(nèi)穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)可以確定在顯色后1h內(nèi)測(cè)定。

2.5.2總?cè)圃碥盏姆€(wěn)定性考察取藥材約0.5g，精密稱定，按\"2.2\"項(xiàng)下的供試品制備方法制備溶液，精密量取該供試品溶液0.2mL，水浴蒸干，加入5%的香草醛冰醋酸溶液0．2mL和0.8mL的高氯酸，在60℃下反應(yīng)15min，冰水冷卻，加5mL冰醋酸，在反應(yīng)后10min，15min，25min，35min，45min，60min，在波長(zhǎng)555nm下測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示：在60min內(nèi)6次測(cè)定值的RSD為0.94%（n=6），表明溶液在1h內(nèi)穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)可以確定在顯色后1h內(nèi)測(cè)定。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

2.6.1多糖的重復(fù)性考察取一份藥材約0.5g，精密稱定，分別精密量取6份供試品溶液0.5mL，按\"2.1\"項(xiàng)下的供試品制備方法制備溶液，在波長(zhǎng)492nm下測(cè)定吸光度，按測(cè)定數(shù)據(jù)求出多糖含量，并求算平均含量和RSD。結(jié)果表明藥材中多糖含量為5.20mg/g，RSD為0.77%（n=6），提示此實(shí)驗(yàn)操作方法的重復(fù)性良好。

2.6.2總?cè)圃碥盏闹貜?fù)性考察取同一樣品6份，按\"2.2\"項(xiàng)下的供試品制備方法制備溶液，在波長(zhǎng)555nm下測(cè)定吸光度，按測(cè)定數(shù)據(jù)求出各自的總?cè)圃碥蘸?，并求算平均含量和RSD。結(jié)果表明藥材中總?cè)圃碥蘸繛?.06%，RSD為0.29%（n=6），提示此實(shí)驗(yàn)操作方法的重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn)

2.7.1多糖的加樣回收率試驗(yàn)精密稱取同一批號(hào)的樣品約0.25g，共6份，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5mL，按\"2.1\"項(xiàng)下的供試品制備方法制備溶液，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，依法顯色，測(cè)定吸光度，按測(cè)定數(shù)據(jù)求出各自的多糖含量，并得到回收率及RSD。結(jié)果表明平均加樣回收率為101.17%，RSD為1.84%（n=6），提示該測(cè)定方法回收率良好，準(zhǔn)確度高，方法可行。

2.7.2總?cè)圃碥盏募訕踊厥章试囼?yàn)精密稱取，樣品共6份，每份樣品約0.25g，分別精密加入三萜皂苷對(duì)照品12.5mg，按\"2.2\"項(xiàng)下的供試品制備方法制備溶液，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，依法顯色，測(cè)定吸光度，按測(cè)定數(shù)據(jù)求出各自的總?cè)圃碥蘸?，并得到回收率及RSD，結(jié)果表明平均加樣回收率為100.74%，RSD為1.29%（n=6），提示該測(cè)定方法回收率良好，準(zhǔn)確度高，方法可行，見表1，表2。

2.8測(cè)定各批次靈芝孢子粉中多糖、總?cè)圃碥盏暮?/p>

2.8.1靈芝孢子粉中多糖的含量測(cè)定靈芝孢子粉粉末（過四號(hào)篩）0.5g，精密稱定，按\"2.1\"項(xiàng)中供試品溶液的制備方法制備。分別精密吸取0.5mL樣品溶液至試管中，加入1.0mL的5%苯酚溶液，迅速加入7.0mL濃硫酸，加蒸餾水至刻度，振搖5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸餾水為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)492nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液中含多糖的含量，計(jì)算其含量。

2.8.2靈芝孢子粉中總?cè)圃碥盏暮繙y(cè)定分別取各產(chǎn)地靈芝孢子粉粉末約0.5g，精密稱定，按\"2.2\"項(xiàng)中供試品溶液的制備方法制備。分別精密吸取0.2mL樣品溶液至試管中，水浴蒸干，加入5%的香草醛冰醋酸溶液0.2mL和0.8mL的高氯酸，在60℃下反應(yīng)15min，冰水冷卻，加5mL冰醋酸，在波長(zhǎng)555nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液中含總?cè)圃碥盏暮?，?jì)算其含量，見表3。

3討論

3.1三萜皂苷的對(duì)照品的選擇國(guó)內(nèi)靈芝孢子粉存在價(jià)格昂貴、無統(tǒng)一法定標(biāo)準(zhǔn)等問題，中國(guó)藥典多以多糖作為質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，日本以三萜成分靈芝酸作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)靈芝孢子粉的研究，因無靈芝酸對(duì)照品供應(yīng)，國(guó)內(nèi)多以熊果酸或五環(huán)三萜齊墩果酸為對(duì)照品，本研究以五環(huán)三萜齊墩果酸為對(duì)照品，作為測(cè)定三萜皂苷含量測(cè)定的對(duì)照品，為靈芝孢子粉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的指標(biāo)。

3.2不同產(chǎn)地的多糖、三萜皂苷含量結(jié)果分析由表3可知，不同產(chǎn)區(qū)靈芝孢子粉的多糖、三萜皂苷含量差別較大。不同產(chǎn)區(qū)靈芝孢子粉的三萜皂苷含量由高到低依次為：山東濟(jì)寧、安徽金寨、山東春江、安徽霍山一品堂、江蘇大豐、吉林長(zhǎng)春、安徽亳州。產(chǎn)于山東濟(jì)寧的靈芝孢子粉中三萜皂苷的含量為5.05%，其三萜皂苷含量為所采集產(chǎn)區(qū)中最高。不同產(chǎn)區(qū)靈芝孢子粉的多糖含量由高到低依次為：安徽霍山一品堂、安徽金寨、山東濟(jì)寧、江蘇大豐、安徽亳州、山東春江、吉林長(zhǎng)春。安徽霍山一品堂產(chǎn)的多糖含量為2.28%，其多糖含量為所采集產(chǎn)區(qū)中最高。不同產(chǎn)地靈芝孢子粉的多糖和三萜皂苷含量存在差異，可能因?yàn)榈乩憝h(huán)境、氣候等因素的影響靈芝孢子粉的化學(xué)成分。

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