摘要：目的 運(yùn)用聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）法對(duì)結(jié)核性腹腔積液進(jìn)地診斷，并探討其應(yīng)用價(jià)值。方法 對(duì)62例明確診斷為結(jié)核性腹腔積液及54例惡性腫瘤性腹腔積液（對(duì)照組）分離其中單個(gè)核細(xì)胞，采用TB-ELISPOT法檢測(cè)其結(jié)核菌抗原特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，同時(shí)對(duì)腹腔積液TB-DNA采用熒光定量PCR法檢測(cè)，并比較兩種方法的特異性和靈敏度。結(jié)果 TB-ELISPOT法及TB-PCR法檢測(cè)腹腔積液，其靈敏度分別為93.5%、64.5%，兩種方法相比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=15.1，P<0.01)；兩種方法檢測(cè)的特異性分別為94.4%、85.2%，經(jīng)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.49，P>0．05)。結(jié)論 TB-ELISPOT法對(duì)腹腔積液進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)靈敏度高、特異性好，是一種較為理想的實(shí)驗(yàn)室輔助診斷方法。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)；腹腔積液；結(jié)核；診斷腹腔積液在臨床上較為常見，以往對(duì)于結(jié)核性腹腔積液的實(shí)驗(yàn)室檢查多采用涂片找抗酸桿菌及PCR法檢測(cè)結(jié)核桿菌，但這些方法靈敏度不夠理想，近年來(lái)也有很多文獻(xiàn)報(bào)道了采用ADA、CEA對(duì)鑒別結(jié)核性、癌性胸腹腔積液的應(yīng)用價(jià)值，但而這些方法特異性較差，特別是40歲以上的結(jié)核性與癌性腹腔積液的鑒別較為困難[1]。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）是由Czerkinsky等于1983年建立的一種對(duì)于單細(xì)胞水平分泌特異性抗體的新免疫學(xué)方法，以后運(yùn)用于檢測(cè)分泌細(xì)胞因子的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。由于結(jié)核桿菌可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，Lalvani等首先將ELISPOT法用于結(jié)核診斷，以往曾有關(guān)于ELISPOT法檢測(cè)血液中特異性T淋巴細(xì)胞的報(bào)導(dǎo)[2]。本文對(duì)腹腔積液采用ELISPOT法檢測(cè)，并探討其在對(duì)結(jié)核性腹腔積液診斷價(jià)值。

1資料與方法

1.1一般資料2011年8月~2012年10月我院住院患者，共116例。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)、病理結(jié)果及檢臨床表現(xiàn)確診為結(jié)核性腹膜炎患者62例，年齡17～51歲，平均年齡33歲。對(duì)照組為54例惡性腫瘤患者，年齡25～54歲，平均34歲。臨床醫(yī)師腹穿采集腹腔穿刺液標(biāo)本。

穿刺液用EDTA-K2進(jìn)行抗凝后，取8ml穿刺液并使用Ficoll-Hypaque進(jìn)行密度梯度離心分離其中的單個(gè)核細(xì)胞。分離后的單個(gè)核細(xì)胞于-80℃環(huán)境下貯存。

1.2試劑與儀器熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)TB-DNA試劑購(gòu)于達(dá)安基因生物公司，儀器為ABI 7300熒光定量PCR儀。Cryostar凍存液及結(jié)核桿菌TB-ELISPOT試劑盒購(gòu)于北京達(dá)科為生物技術(shù)公司。

1.3對(duì)穿刺液沉淀提取物進(jìn)行結(jié)核桿菌DNA PCR檢測(cè)，按照試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后，通過ABI 7300PCR分析儀軟件分析判斷，并報(bào)告TB-DNA拷貝數(shù)量，當(dāng)DAN含量>103考貝/ml時(shí)為陽(yáng)性。

1.4 ELISPOT法為貯存一定數(shù)量后批量檢測(cè)。PCR法對(duì)送檢后穿液抗凝離心后取沉淀物對(duì)單個(gè)或多個(gè)標(biāo)本分次檢測(cè)。TB ELISPOT檢測(cè)運(yùn)用ESAT-6（結(jié)核早期分泌抗原靶分子）和CFP-10(培養(yǎng)濾液蛋白10)兩種抗原刺激，本試驗(yàn)在已包被抗體的孔中直接刺激細(xì)胞采用直接ELISPOT法，以PHA為陽(yáng)性對(duì)照刺激物，每孔加樣100 ul，加入的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)重懸液濃度為2～5×106/100ul， 按試劑盒說明進(jìn)行其具體操作，檢測(cè)結(jié)果亦依據(jù)試劑盒說明的標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.5統(tǒng)計(jì)方法使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果的特異性及靈敏度進(jìn)行分析比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

采用ELISPOT法對(duì)62例結(jié)核患者的穿刺液檢出陽(yáng)性58例，采用PCR法檢出陽(yáng)性40例，兩種方法的靈敏度比較P<0.01，其差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

對(duì)54例作為陰性對(duì)照惡性腫瘤患者的穿刺液分別采用ELISPOT法及PCR法，兩者特異性分別為94.4%和85.2%，兩種方法的特異性比較P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

3討論

本文通過對(duì)腹腔穿刺液選取TB-PCR法及ELISPOT法進(jìn)行檢測(cè)并比較。TB-EIISPOT法使用重組CFP-10和ESAT-6，這兩種蛋白具有和天然蛋白相同抗原性，可使結(jié)核桿菌再感染的記憶性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞增殖并產(chǎn)生大量INF-γ。本文所采用的ELISPOT法利用結(jié)核桿菌感染者腹腔積液中存在結(jié)核菌特異的活化T細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入ESAT-6和CFP-10為結(jié)核桿菌特異混合抗原，刺激這些效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌γ干擾素。其分泌的INF-γ被微孔板上的特異抗體所捕獲，再次加入的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體針對(duì)INF-γ不同表位結(jié)合，并滯留于微孔板表面。底物溶液顯色并在反應(yīng)部位被酶分解后形成不溶性色素沉淀斑。斑點(diǎn)數(shù)代表γ干擾素分泌細(xì)胞數(shù)量。對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)后可以檢測(cè)腹腔液內(nèi)是否存在對(duì)核菌反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞，從而輔助診斷結(jié)核桿菌感染情況。與ELISA相比，ELISPOT法更靈敏，它可以從20萬(wàn)-30萬(wàn)單個(gè)核細(xì)胞中檢出一個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。

以往有文獻(xiàn)采用PCR法檢測(cè)胸腹水中TB-DNA[3]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)腹腔積液用TB-ELISPOT法與TB-PCR法相比，結(jié)果表明EIISPOT具有較高敏感性。使用的結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白CFP-10和特異性抗原多肽ESAT-6，其特異性良好，可達(dá)94.4%。并且可以避免接種卡介苗(BCG)及其他分枝桿菌感染的交叉反應(yīng)，只要對(duì)其中一種多肽的T細(xì)胞反應(yīng)達(dá)到要求就可判讀為陽(yáng)性[4]。以往對(duì)于結(jié)核性腹膜炎的診斷多根據(jù)臨床特點(diǎn)及影像學(xué)檢查，而本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)腹腔液分離其中的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行結(jié)核桿菌EIISPOT法檢測(cè)，這樣可以直接地進(jìn)行結(jié)核性感染的診斷，具有很好的特異性及敏感性，是一種較為理想的實(shí)驗(yàn)室輔助診斷方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]谷旭紅，閻振元，周清龔，等.腺苷脫氨酶與癌胚抗原的測(cè)定在結(jié)核性與癌性胸水鑒別診斷中的意義[J].河南診斷與治療雜志，2002， 7（6）：402-403.

[2]LalvaniA，PathanAA，McShaneH，et a1.Rapid detection of Mycobacterium Tuberculosis infection by enumeration of antigen specific T cells[J]. Am J Respir Care Med，2001，163(4):807-808．

[3]孫慶.熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)胸腹水抗酸桿菌的臨床應(yīng)用[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（13）：1479-1480.

[4]Philip C，Dolly Jackson-Sillah，Annette Fox，el a1．ESAT-6/CFP-10 Fusion Protein and Peptides for()primal Diagnosis of Mycobacterium Tuberculosis Infection by Ex Vivo Enzymelinked in Gambia[J]．J Clin Microbiol，2005，43(5)：2070-2074．

編輯/哈濤