艾滋病毒即人類(lèi)免疫缺陷病毒，可嚴(yán)重破壞人體的免疫系統(tǒng)，誘發(fā)嚴(yán)重感染及癌癥，發(fā)展到最后，將會(huì)導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合癥。到2010年底，聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署估計(jì)全世界范圍內(nèi)HIV感染者約3400萬(wàn)，2010年內(nèi)大約有260萬(wàn)HIV新感染者，并有180萬(wàn)人死于AIDS[1]。因此，HIV檢測(cè)對(duì)于艾滋病的篩查、診斷、病程監(jiān)控、指導(dǎo)治療方案具有重要的意義。本文將簡(jiǎn)述近年來(lái)HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，這些檢測(cè)方法對(duì)于控制艾滋病毒的流行，艾滋病毒感染的診斷、篩查、監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。

1HIV感染期間的標(biāo)志物及其意義

在HIV感染后依次能檢測(cè)到病毒RNA，p24抗原，最后是抗體[2]。在感染HIV后2w內(nèi)（10~12d），血液中病毒RNA數(shù)量呈指數(shù)級(jí)遞增。當(dāng)HIV感染者發(fā)展為AIDS后，機(jī)體免疫已不能抑制HIV的復(fù)制，病毒RNA數(shù)量再次呈指數(shù)級(jí)上升。因此病毒RNA水平是判斷病毒復(fù)制情況以及監(jiān)控病情發(fā)展的重要指標(biāo)。HIV感染后的11~13d，血液中就可以檢測(cè)到p24抗原。p24可作為病毒復(fù)制的間接指標(biāo)。p24水平隨HIV的復(fù)制而增加，并在感染后45d內(nèi)保持在較高水平，但由于其檢測(cè)方法較RNA檢測(cè)方法靈敏度低，因此p24檢出時(shí)間比RNA晚[3]。在感染HIV后的很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，不能在宿主體內(nèi)檢測(cè)到HIV特異性抗體，稱(chēng)為“窗口期”?！按翱谄凇钡拈L(zhǎng)短由病毒的致病性和宿主的免疫能力有關(guān)。在窗口期，可以通過(guò)病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴細(xì)胞水平來(lái)確定HIV感染。在HIV感染的整個(gè)過(guò)程中，CD4淋巴細(xì)胞水平逐漸下降，當(dāng)其水平降低至200個(gè)細(xì)胞/毫升血液時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫缺陷，HIV感染者將發(fā)展為AIDS[4]。在大部分HIV感染者體內(nèi)最先出現(xiàn)的抗體類(lèi)型是IgM。IgM一般在HIV感染后第3w出現(xiàn)，并在第4~5w達(dá)到峰值。然而由于個(gè)體差異及方法學(xué)靈敏度等原因，IgM并不能在每個(gè)HIV感染者血液中檢出[5]。HIV特異性IgG通常在感染后3~4w出現(xiàn)，隨后IgG滴度迅速上升，直至10~12w左右開(kāi)始下降。IgG滴度的降低是由IgG3亞型的降低導(dǎo)致的，隨后IgG滴度再次迅速增加[6]。盡管有個(gè)體可能6個(gè)月后才出現(xiàn)HIV抗體，但大多數(shù)HIV感染者血液中2~3個(gè)月都能檢測(cè)到HIV抗體[7]。HIV抗體的出現(xiàn)抑制了HIV病毒的復(fù)制，并形成p24特異性抗體/p24復(fù)合體，降低了血液中的RNA及p24水平。最終，HIV感染者發(fā)展為AIDS，免疫系統(tǒng)崩潰，病毒再次大量復(fù)制，血液中的RNA、p24水平再次升高。因此，通過(guò)檢測(cè)病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴細(xì)胞以及HIV抗體在血液中的含量，可以診斷HIV感染及監(jiān)控病情的發(fā)展。

2HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

2.1 HIV抗體檢測(cè)目前，檢測(cè)HIV抗體的方法多達(dá)100余種，總體來(lái)說(shuō)可以分為篩查試驗(yàn)和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。只有擁有較高靈敏度，即較低假陰性率的檢測(cè)方法才能用于篩查試驗(yàn)。相反，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)對(duì)檢測(cè)方法的要求是高特異性，即檢測(cè)結(jié)果具有較低的假陽(yáng)性率。一般情況下，篩查實(shí)驗(yàn)篩查出陽(yáng)性的標(biāo)本必須要經(jīng)過(guò)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)再次檢測(cè)，以達(dá)到確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果的目的

2.1.1 HIV抗體篩查試驗(yàn)?zāi)壳埃嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是最常用的篩查試驗(yàn)。1985年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)使用第一代ELISA檢測(cè)試劑篩查HIV，可以在感染后40d左右篩查出HIV特異性抗體，第一代試劑主要以病毒的裂解產(chǎn)物或部分純化的病毒抗原包被反應(yīng)板，采用間接法篩查HIV。由于常混雜有細(xì)胞培養(yǎng)中的蛋白成分或其他雜蛋白而出現(xiàn)較多的假陽(yáng)性反應(yīng)。1990年，第二代ELISA試劑將重組或合成的多肽抗原（包括M，N，O）包被在反應(yīng)板中，實(shí)現(xiàn)了HIV-I和HIV-II同時(shí)檢測(cè)，并將檢出時(shí)間縮短為33~35d。由基因重組獲得的抗原具有良好的同源性，產(chǎn)品的靈敏度與特異度較第一代試劑有了很大的提高[8]。1992年，第三代ELISA試劑檢測(cè)方法與前兩代不同，采用雙抗原夾心法檢測(cè)抗體。由于其可以檢測(cè)所有抗體亞型(包括IgG，IgM，IgA)，因此具有更高的靈敏度與特異性。第三代ELISA試劑將HIV抗體檢測(cè)的“窗口期”縮短為22天左右。第四代ELISA試劑在第三代的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加了p24抗原的檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)HIV抗體及p24抗原，進(jìn)一步縮短了“窗口期”，減少了急性感染窗口期漏檢。但由于“第二窗口期”的存在，也使得第四代試劑檢測(cè)的敏感性受到影響[9]。目前，在我國(guó)第三代試劑應(yīng)用最為廣泛，第四代試劑還沒(méi)有普及。第三代和第四代試劑的特異性大約在99.5%~99.9%，這就意味著可能會(huì)有一定假陽(yáng)性的出現(xiàn)。假陽(yáng)性結(jié)果一般是由于非特異性抗體結(jié)合HIV抗原導(dǎo)致的[10]。某些病毒感染的患者在進(jìn)行HIV篩查時(shí)可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。此外，患有自身免疫性疾病、惡性淋巴瘤的患者也可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果[11]。鑒于篩查實(shí)驗(yàn)可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，只有進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)后才能得出HIV陽(yáng)性的結(jié)論。

2.1.2 HIV抗體確認(rèn)試驗(yàn)?zāi)壳?，HIV確認(rèn)實(shí)驗(yàn)主要有免疫印跡實(shí)驗(yàn)（western blot，WB）和線性免疫分析法（line immune assays，LIA）兩種，其中前者最為常用。WB通過(guò)SDS-PAGE電泳將HIV全病毒抗原按照分子量的大小分離開(kāi)來(lái)，然后再?gòu)哪z轉(zhuǎn)移到固相支持物硝酸纖維素膜上。如HIV-1，分離開(kāi)來(lái)的病毒抗原可分為三帶：①env帶，指gp160、gp120、gp41；②gag帶，指p55、p24/25、p17；③pol帶，指p68、p52、p40、p34。經(jīng)稀釋過(guò)的待檢血清樣品直接加到硝酸纖維素膜上，若血清中含有HIV抗體，則會(huì)與膜上的抗原帶結(jié)合。然后加入酶標(biāo)的第二抗體和底物，根據(jù)條帶的顯色情況來(lái)判定結(jié)果。根據(jù)國(guó)際公認(rèn)的美國(guó)CDC判斷標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)以下兩種情況就可判斷為陽(yáng)性：①至少有二條env帶（gp160/gp120和gp41）；②至少有一條env帶和p24帶同時(shí)出現(xiàn)。目前，HIV商品化試劑盒同時(shí)含有HIV-1與HIV-2抗原，可實(shí)現(xiàn)兩種亞型的同時(shí)檢測(cè)。與ELISA方法相比較，WB具有更高的敏感度和特異性，然而由于病毒在濃縮和純化后仍可能存在培養(yǎng)用的宿主細(xì)胞，出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，大多數(shù)出現(xiàn)在中分子量區(qū)域，產(chǎn)生不確定結(jié)果。線性免疫分析法原理與蛋白質(zhì)印跡法相似，但與蛋白質(zhì)印跡法相比較，線性免疫分析法價(jià)格較為昂貴，應(yīng)用受到限制。

2.2 HIV快速檢測(cè)試驗(yàn)HIV快速檢測(cè)試驗(yàn)主要包括免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、免疫層析試驗(yàn)以及凝集試驗(yàn)等。HIV快速檢測(cè)試驗(yàn)可檢測(cè)血漿、末梢血、尿液、唾液等標(biāo)本，并在30min鐘內(nèi)完成檢測(cè)，因此在一些緊急篩查時(shí)，如急診手術(shù)、穿刺等，顯得尤為重要。然而，有調(diào)查表明HIV快速檢測(cè)試驗(yàn)的敏感度僅為90.2%，其敏感度與ELISA和WB相比要低得多，因此將會(huì)導(dǎo)致漏檢情況的出現(xiàn)[12]。此外，HIV快速檢測(cè)試驗(yàn)的特異性也較低。據(jù)Gray的一份研究表明，94.1%快速檢驗(yàn)弱陽(yáng)性的標(biāo)本經(jīng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)復(fù)檢后得出陰性或不確定的結(jié)論[13]。鑒于快速檢驗(yàn)敏感度和特異性較低，專(zhuān)家建議快速檢驗(yàn)應(yīng)與ELISA或WB聯(lián)合應(yīng)用[14]。HIV快速檢測(cè)試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，成本較低，要求的標(biāo)本量較小，適合于基層醫(yī)院HIV的快速篩查，尤其對(duì)發(fā)展中國(guó)家或偏遠(yuǎn)地區(qū)具有重要的意義[15]。

2.3 HIV核酸檢測(cè)隨著技術(shù)的發(fā)展，核酸檢測(cè)的靈敏度已經(jīng)得到質(zhì)的飛躍，甚至達(dá)到超靈敏，使一些極為微量的RNA樣品分析成為可能。目前，HIV核酸檢測(cè)方法主要包括聚合酶鏈反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增，支鏈DNA，連接酶鏈反應(yīng)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等。這些方法在許惠敏等的論述中已有詳細(xì)描述，在此不再贅述[16]。HIV病毒RNA檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)病毒抗轉(zhuǎn)錄治療后的監(jiān)測(cè)，病毒載量與HIV病毒RNA成平行關(guān)系。隨著第三代及第四代ELISA試劑的應(yīng)用，HIV血液傳播被有效的控制，然而如果進(jìn)一步降低“窗口期”的傳播，就需要核酸檢測(cè)進(jìn)行支持。HIV病毒的易變性也嚴(yán)重影響著核酸檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)存在HIV變種的情況時(shí)，引物和探針都具有特異性不能發(fā)揮擴(kuò)增的作用，因此HIV核酸檢測(cè)應(yīng)用受到限制。

2.4流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞儀是一種能夠探測(cè)和計(jì)數(shù)以單細(xì)胞液體流形式穿過(guò)激光束的細(xì)胞檢測(cè)裝置，是分離和鑒定細(xì)胞群及亞群的一種強(qiáng)有力的應(yīng)用工具。淋巴細(xì)胞是正常機(jī)體免疫系統(tǒng)功能最重要的一大細(xì)胞群，在免疫應(yīng)答過(guò)程中，淋巴細(xì)胞發(fā)育成功能不同的亞群，各亞群的數(shù)量和功能產(chǎn)生異常時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂并產(chǎn)生病理變化。HIV病毒感染整個(gè)過(guò)程中，總CD4淋巴細(xì)胞水平隨感染的發(fā)展而逐漸降低，當(dāng)其在血液中下降到200個(gè)/ml時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫功能障礙，即發(fā)展為AIDS。通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)血液中的T細(xì)胞亞群分類(lèi)并計(jì)數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)HIV感染者血液中的T淋巴細(xì)胞總數(shù)及百分?jǐn)?shù)、CD4淋巴細(xì)胞及百分?jǐn)?shù)、CD4淋巴細(xì)胞與CD8淋巴細(xì)胞比值均降低，從而提示HIV感染的可能性。

在過(guò)去的20多年里，隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，HIV檢測(cè)方法也在不斷的提高，HIV感染的窗口期也隨之縮短。隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展以及HIV感染機(jī)制的明確，新的檢測(cè)技術(shù)將會(huì)出現(xiàn)，為HIV感染的篩查、診斷、監(jiān)測(cè)及控制提供強(qiáng)有力的支持。

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編輯/王敏