摘要：目的探討建立PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型的方法，優(yōu)化PTZ誘導(dǎo)濃度及評價指標(biāo)。方法在斑馬魚PTZ誘導(dǎo)癲癇模型中，分別對不同濃度PTZ（1.25、2.5、5、10、20、30 mM）、不同的觀察指標(biāo)（快速運動距離、中速運動距離、慢速運動距離、總的運動距離）進行分析。結(jié)果PTZ在10 mM濃度下快速運動距離（V>20 mm/sec）與溶劑組相比，差異顯著（P<0.01），誘導(dǎo)效率最佳。因此，本模型選擇PTZ 10 mM作為誘導(dǎo)濃度，快速運動距離（V>20 mm/sec）的改變作為藥效評價指標(biāo)。結(jié)論斑馬魚PTZ誘導(dǎo)癲癇模型中， 10 mM PTZ為最佳誘導(dǎo)濃度，快速運動距離的改變?yōu)樽罴训乃幮гu價指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：戊四唑；斑馬魚；癲癇；藥學(xué)評價戊四唑（Pentylenetetrazole， PTZ）是γ-氨基丁酸（簡稱GABA）抑制劑，GABA是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)物質(zhì)[1，2]。研究表明，大劑量的PTZ可誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，是哺乳動物癲癇模型中的常用誘導(dǎo)劑[3，4]。最近，采用PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型的成功建立，為天然藥物的藥學(xué)評價和藥物篩選創(chuàng)造了更為有力的條件[5，6]。但斑馬魚癲癇模型的優(yōu)化及評價指標(biāo)存在很多的爭議[5]。 本實驗探討建立PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型的方法，優(yōu)化PTZ誘導(dǎo)濃度及藥學(xué)評價指標(biāo)，為高通量的天然藥物篩選提供更為有力的實驗證據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對交配的方式進行。每次交配準(zhǔn)備4~5對成年斑馬魚，平均每對能產(chǎn)200~300個胚胎。在受精后6h（即6 hpf）和24 hpf 對胚胎進行清理（移除已死亡胚胎），并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。解剖顯微鏡（SMZ645，Nikon公司）；48/96孔板（Nest Biotech）；行為分析儀（V3，ViewPoint Life Sciences公司）；二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁，批號1095515）；戊四唑（Pentylenetetrazole，PTZ）購自美國sigma公司，批號069K1245。

1.2方法在 28 ℃ 條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎（養(yǎng)魚用水水質(zhì)：每1L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為 480~510 μS/cm；pH 為 6.9~7.2；硬度為 53.7~71.6 mg/L CaCO3）。 在斑馬魚PTZ誘導(dǎo)癲癇模型中，分別對不同濃度PTZ（1.25、2.5、5、10、20、30 mM）誘導(dǎo)斑馬魚癲癇?？瞻讓φ战M為0.1% DMSO，所有實驗組均含有相同濃度的溶劑。每個實驗組均處理8尾斑馬魚。加入藥物后，利用運動/行為分析儀記錄60 min內(nèi)斑馬魚快速運動距離（V>20 mm/sec）、中速運動距離（4

1.3數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)均用Mean±SE表示。用方差分析和Dunnett's T-檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05表明具有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1 PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型的建立和優(yōu)化以48孔板第一板摸索PTZ誘導(dǎo)濃度為例，分別統(tǒng)計分析斑馬魚不同運動速度下的運動距離，見表1。結(jié)果顯示：與溶劑組相比，PTZ在5、10 mM濃度下快速運動距離顯著增加（P<0.05，P<0.01）；而PTZ各濃度組在中速運動距離、慢速運動距離及總的運動距離各指標(biāo)均無顯著性差異。因此，此模型中評價指標(biāo)選擇快速運動距離進行統(tǒng)計分析，此模型中的快速運動相當(dāng)于哺乳動物陣攣發(fā)作狀態(tài)。

2.2 PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型中最佳濃度確定在48孔板實驗中，PTZ在5、10、20 mM濃度下，誘導(dǎo)組的快速運動距離較溶劑組相比，均顯著增加（P< 0.05）。2次實驗中10 mM濃度PTZ均表現(xiàn)出較好的誘導(dǎo)效率。PTZ在30 mM濃度下，其快速運動距離較溶劑組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異，較20 mM濃度相比，其快速運動距離反而降低，可能與PTZ引起斑馬魚神經(jīng)毒性有關(guān)，見圖1~4。在96孔板實驗中，PTZ在2.5、5、10、20 mM濃度下，誘導(dǎo)組的快速運動距離較溶劑組相比，均顯著增加（P<0.01），其中10 mM濃度下，快速運動距離增加最大；PTZ在30 mM濃度下，其快速運動距離較溶劑組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果與48孔板中實驗結(jié)果一致，見圖5-6。

3討論

藥理學(xué)和毒理學(xué)評價是新藥臨床前安全性評價不可分割的一部分。隨著創(chuàng)新藥物開發(fā)成本的不斷升高，降低藥物開發(fā)過程中的損耗率日益得到關(guān)注。近年來，斑馬魚作為整體動物篩選平臺已成為一種在國際上受廣泛關(guān)注的全新技術(shù)。這項技術(shù)的最大優(yōu)點是在篩選時可以對藥物的效果和對動物的毒性一目了然。而且，如果采用斑馬魚動物模型，利用它生長周期短和獲得ADME/T信息多的特點，可以大大加快篩選化合物的速度，從而降低成本，顯著減少新藥研發(fā)的成本。

早期的研究表明，通過觀察浸浴于盛有藥液的96孔平板的小孔內(nèi)的斑馬魚，可研究藥物對運動行為的不良影響。利用這種方法已經(jīng)觀察到了常用鎮(zhèn)靜劑如地西泮、褪黑激素對斑馬魚的鎮(zhèn)靜作用，以及興奮劑咖啡因?qū)Π唏R魚的興奮作用[7]。將斑馬魚暴露于常用的驚厥劑中，可引發(fā)斑馬魚產(chǎn)生驚厥。這一系統(tǒng)也用來檢測新化合物的致驚厥作用[8]。但斑馬魚癲癇模型的優(yōu)化及評價指標(biāo)存在很多的爭議[5]。 本實驗在斑馬魚PTZ誘導(dǎo)癲癇模型中，分別對不同濃度PTZ（1.25、2.5、5、10、20、30 mM）、不同的觀察指標(biāo)（快速運動距離、中速運動距離、慢速運動距離、總的運動距離）進行了分析。結(jié)果表明，PTZ在10 mM濃度下快速運動距離（V>20 mm/sec）與溶劑組相比，差異顯著（P< 0.01），誘導(dǎo)效率最佳。因此，本模型選擇PTZ 10 mM作為誘導(dǎo)濃度，快速運動距離（V> 20 mm/sec）的改變作為藥效評價指標(biāo)。

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編輯/申磊