摘要:目的 觀察益智健腦顆粒對老年大鼠海馬膽堿能毒蕈堿M受體亞單位表達的影響。方法 青年對照組(A)10只,為3個月齡大鼠,于取材前1 w購入。20只24個月齡雄性SD大鼠購入后,觀察1w無異常,隨機分兩組,分別為老年對照組(B)、益智健腦顆粒組(C),各10只。益智健腦顆粒組每天灌藥量10 g/Kg,共30 d;青年對照組與老年對照組給予同體積生理鹽水灌胃。取材時以4℃ 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液大腦灌注固定、制備腦組織切片,免疫組化染色,觀察各組大鼠海馬膽堿能毒蕈堿M受體亞單位的表達。結(jié)果 各組大鼠海馬膽堿能毒蕈堿M受體亞單位在CA1區(qū)、CA3區(qū)表達存在差異,老年對照組呈弱陽性反應(yīng),益智健腦顆粒組大鼠海馬M受體亞單位陽性反應(yīng)在CA1區(qū)明顯,在CA3區(qū)表達相對較弱。結(jié)論 益智健腦顆粒能調(diào)節(jié)膽堿能毒蕈堿M受體的表達水平,對衰老大鼠海馬的中樞膽堿能系統(tǒng)有一定的保護作用。
關(guān)鍵詞:益智健腦顆粒;海馬;膽堿能毒蕈堿M受體
從生物學(xué)上講,衰老是生物伴隨時間推移自發(fā)的必然過程,表現(xiàn)為形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的衰退。人在自然衰老時,不同程度會出現(xiàn)記憶力減退、反應(yīng)遲鈍等腦功能障礙癥狀,并隨年齡增長癥狀會越來越嚴重[1]。研究衰老記憶減退機制,探尋有效的抗衰老治療途徑,對于實現(xiàn)健康老齡化具有重要的現(xiàn)實意義。本課題組自2011年開始一直致力于中藥復(fù)方對老年大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及機制研究,發(fā)現(xiàn)益智健腦顆粒在改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶上有一定療效,現(xiàn)對其可能機制作進一步探討。
1資料與方法
1.1動物 清潔級24月齡健康雄性SD大鼠20只,體重(450±20) g,另于實驗取材前1 w購入3個月齡健康雄性SD大鼠10只,體重體重(250±20) g,動物均由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。
1.2藥物 益智健腦顆粒由淫羊藿、何首烏、水蛭、當歸、鎖陽、川斷、田七、白芍、刺五加、柏子仁等藥物組成,其水提濃縮液每毫升含生藥3g(湖南德康制藥有限公司)。
1.3試劑 牛血清白蛋白( 國藥集團化學(xué)試劑有限公司);小鼠SP檢測試劑盒( 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗M1受體多克隆抗體(Santa cruz公司)。
1.4儀器與設(shè)備 Leica-2016型切片機,德國徠卡儀器有限公司產(chǎn)品;Olympus-BX41顯微鏡,日本;JVCTK-C1381數(shù)字彩色照相機,日本。
1.5方法
1.5.1分組 20只24個月齡雄性SD大鼠購入后,觀察1 w無異常,隨機分成兩組:老年對照組﹙10只﹚和益智健腦顆粒組﹙10只﹚。青年對照組﹙10只﹚,為3個月齡雄性SD大鼠,于取材前一周購入。三組大鼠均分籠飼養(yǎng),﹙25±2﹚℃,濕度50%~60%,自然晝夜節(jié)律,自由飲水,保持室內(nèi)安靜。
1.5.2給藥 益智健腦顆粒組每天灌藥量10 g/Kg,共30 d;青年對照組與老年對照組給予同體積生理鹽水灌胃。
1.5.3組織切片制備 大鼠以10%水合氯醛(0.35ml/100g)進行腹腔麻醉,打開腹腔,用止血鉗夾住腹主動脈和下腔靜脈;繼之打開胸腔暴露心臟,用制備的平頭注射針經(jīng)左心室插入升主動脈,用止血鉗夾住心尖部位,然后剪開右心耳,以預(yù)冷的0.9%的生理鹽水快速灌注250 mL左右,沖洗干凈的標準是以肝臟顏色由棕紅色變?yōu)榘咨?。繼而灌注4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛200~300 mL(0.1 M PB配置,pH 7.4),按照先快后慢的速度于40 min內(nèi)灌注完畢。灌注結(jié)束后,迅速開顱取腦,置于4%的多聚甲醛中4℃后固定過夜。第2 d切取包含海馬部位的腦組織塊,移入20%蔗糖溶液(0.1M PB配置,pH 7.4),置冰箱(4℃)待腦組織塊沉底后,再轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液(0.1M PB配置,pH 7.4),待再次沉底后置冰箱(4℃)保存。將腦組織塊行冠狀位冰凍切片,片厚30 μm。每隔5片取1張,每例動物相鄰切片分為3套,每套各5張,選取其中一套進行免疫組織化學(xué)染色。
1.5.4免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色步驟如下:(SABC法)①選取冰凍切片于24孔培養(yǎng)板,0.01M PBS漂洗5 min×3次;②現(xiàn)配3%H202室溫30 min,滅活內(nèi)源性過氧化物酶;③0.01M PBS漂洗5 min×3次;④滴加10%正常山羊封閉血清,室溫濕盒內(nèi)孵育30 min;⑤吸干正常山羊封閉血清,滴加兔抗M1受體多克隆抗體﹙滴度:1∶100﹚工作液,濕盒內(nèi)4℃孵育過夜;⑥0.01M PBS沖洗5 min×3次,加入相應(yīng)生物素化二抗,37℃孵育2 h;⑦0.01M PBS沖洗5 min×3次,滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶親合素37℃孵育2 h;⑧0.01 M PBS沖洗5 min×3次,DAB顯色3 min;⑨常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。對照實驗以正常山羊血清和PBS代替一抗,同步進行免疫組織化學(xué)染色,最后進行顯微鏡下觀察。
2結(jié)果
用免疫組織化學(xué)染色法顯示的各組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)膽堿能毒蕈堿M受體亞單位M1的表達和分布情況。圖1~2中A,B,C分別為青年對照組、老年對照組和益智健腦顆粒組。從免疫反應(yīng)染色的整體情況看,各組大鼠海馬錐體層細胞染上了深棕黃色,在錐體細胞周圍未見其他細胞有著色。
圖1和圖2分別顯示海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)膽堿能毒蕈堿受體M1的分布特征。M1陽性細胞的染色反應(yīng)主要集中在細胞膜和細胞漿內(nèi),被染成深棕黃色。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上看,青年對照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞均排列整齊緊密,層次結(jié)構(gòu)明顯,突起明顯;老年對照組海馬錐體細胞排列非常稀疏,輪廓不清,細胞間隙大,甚至出現(xiàn)缺失,細胞層次結(jié)構(gòu)不明顯,染色最淺;益智健腦顆粒組海馬錐體細胞排列相對緊密,介于上述兩組之間,對M1受體蛋白表達有明顯增強作用,層次結(jié)構(gòu)較明顯,染色較深。青年對照組大鼠海馬CA3區(qū)錐體細胞均排列非常緊密,層次結(jié)構(gòu)明顯,細胞核呈現(xiàn)一定反應(yīng)陽性;老年對照組海馬錐體細胞排列稀疏,有一定的層次性,但輪廓不太清晰,細胞間隙大;益智健腦顆粒組海馬錐體細胞排列相對緊密,介于上述兩組之間,細胞層次結(jié)構(gòu)模糊,突起明顯,對M1受體蛋白表達有一定增強作用。
3討論
在研究膽堿能受體的過程中,研究者發(fā)現(xiàn)不同的M受體亞型對學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)不完全相同,其中 M1、M4為突觸后受體并引起乙酰膽堿的釋放量增 加[2]。腦衰老時明顯改變的是毒蕈堿受體數(shù)目降低,尤其是M1亞型受體[3]。老年人與老年性癡呆癥患者皮層的海馬膽堿能毒蕈堿受體明顯減少,不同齡大鼠大腦紋狀體區(qū)域的M-AchR數(shù)量也隨年齡而變化,但其結(jié)合能力并無 改變[4]。用放射自顯影方法研究表明,老年大鼠大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體部位M1亞型受體密度顯著低于青年對照鼠,并提出這三個腦區(qū)M1亞型受體密度的降低可能是衰老時學(xué)習(xí)、記憶、聯(lián)想、認知等功能障礙的重要機制之一[5]。大鼠被動逃避反應(yīng)(passive avoidance task,PAT) 訓(xùn)練后立即海馬內(nèi)注射M1、M4受體高選擇性的蛇毒毒素發(fā)現(xiàn),M1、M4受體促進PAT的獲得,提示M1、M4受體對學(xué)習(xí)記憶具有正性調(diào)節(jié)作用[6]。
我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)提出人體進入老年,或腎陽漸衰,血行遲緩,血寒而凝;或腎陰虧虛,陰虛燥熱,耗津灼血,血粘成瘀。最終都會形成瘀血停滯,臟腑失于濡養(yǎng),加速機體衰老,加重腎虛,日久便逐漸形成\"腎虛導(dǎo)致血瘀;血瘀加重腎虛\"的惡性循環(huán)。腎虛則髓海失養(yǎng),腦髓漸空; 瘀血阻滯,則氣血無以上榮腦竅。腎虛與血瘀相伴同行,漸致髓??仗?,神機失用,智能減退,發(fā)為癡呆。據(jù)此,為我們以自然衰老大鼠為腎虛血瘀模型,從“補腎活血法”的角度,選取益智健腦方抗衰老研究提供了理論根據(jù)。
益智健腦方由淫羊藿、何首烏、水蛭、當歸、鎖陽、川斷、田七、白芍、刺五加、柏子仁等藥物組成。方中淫羊藿、首烏補腎壯陽益精血,共為君藥;當歸、水蛭活血化瘀,同為臣藥;田七活血化瘀,川斷補腎行血,鎖陽補腎助陽,少用白芍,利用其酸斂之性,一可防活血有傷血動血之弊,二可佐制補腎藥物之燥性,兼顧陰陽,上述藥物共為佐藥;刺五加補腎安神,柏子仁寧心健腦,共為使藥。諸藥并用,共奏補腎活血之效?,F(xiàn)代藥理實驗證明,中藥益智健腦顆粒通過改善能量代謝、抑制細胞凋亡、構(gòu)成細胞骨架、增加激素等多途徑、多靶點治療AD[7]。益智健腦顆粒還能阻止模型鼠BDNF的下調(diào)[8],改善AD模型鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。本實驗的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),各組大鼠海馬膽堿能毒蕈堿M受體亞單位在CA1區(qū)、CA3區(qū)表達存在差異,老年對照組呈弱陽性反應(yīng),益智健腦顆粒組大鼠海馬M受體亞單位陽性反應(yīng)在CA1區(qū)明顯,在CA3區(qū)表達相對較弱。研究表明益智健腦顆粒能調(diào)節(jié)膽堿能毒蕈堿M受體的表達水平,對衰老大鼠海馬的中樞膽堿能系統(tǒng)有一定的保護作用,這也許是益智健腦顆粒抗衰老的作用機制之一。
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