摘要：膈神經(jīng)放電可反映呼吸運(yùn)動(dòng)狀態(tài)及呼吸中樞的電活動(dòng)，通過大鼠膈神經(jīng)放電記錄實(shí)驗(yàn)可使學(xué)生系統(tǒng)深入地理解呼吸生理，培養(yǎng)學(xué)生綜合分析和解決問題的能力。本文從膈神經(jīng)放電記錄的詳細(xì)過程、注意事項(xiàng)及實(shí)驗(yàn)體會(huì)，系統(tǒng)展開綜述報(bào)告，為教學(xué)及科研需要而進(jìn)行的該類實(shí)驗(yàn)提供參考。

關(guān)鍵詞：膈神經(jīng)放電；實(shí)驗(yàn)；綜述報(bào)告

膈肌是重要的吸氣肌[1]，膈神經(jīng)作為膈肌唯一的傳出神經(jīng)便成為觀察呼吸效應(yīng)的一個(gè)最重要的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，同時(shí)，膈神經(jīng)電活動(dòng)與呼吸中樞電活動(dòng)密切相關(guān)，二者活動(dòng)變化一致[]，由此可根據(jù)膈神經(jīng)放電活動(dòng)來反應(yīng)呼吸中樞神經(jīng)元放電活動(dòng)情況，為呼吸相關(guān)的科學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供客觀指標(biāo)。

1大鼠膈神經(jīng)放電記錄實(shí)驗(yàn)的意義

大鼠是基礎(chǔ)科學(xué)研究中最常用的嚙齒類小動(dòng)物，其90%以上的基因與人類相匹配，市場(chǎng)有現(xiàn)成的針對(duì)大鼠的各種生物抗體，研究方便，且大鼠最易于長(zhǎng)時(shí)間飼養(yǎng)和檢測(cè)肺通氣功能，便于模擬慢性肺疾病模型，尤其大鼠價(jià)格較大動(dòng)物便宜，可大大降低實(shí)驗(yàn)成本，增加更多學(xué)生實(shí)踐動(dòng)手的機(jī)會(huì)。記錄大鼠膈神經(jīng)的放電，是項(xiàng)動(dòng)腦動(dòng)手能力等要求較高的電生理實(shí)驗(yàn)技術(shù)，該實(shí)驗(yàn)?zāi)転閷W(xué)生提供一個(gè)綜合而系統(tǒng)的學(xué)習(xí)鍛煉平臺(tái)，使其能觀察到呼吸運(yùn)動(dòng)的中樞調(diào)節(jié)過程，了解呼吸運(yùn)動(dòng)的電生理記錄方法，從而更深入地理解呼吸的本質(zhì)。通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)過程，能提高學(xué)生分析問題和解決問題的綜合能力，更能激發(fā)學(xué)生的求知欲，開拓其思路，啟發(fā)其創(chuàng)新性思維。

2膈神經(jīng)放電的記錄過程和步驟

2.1 動(dòng)物麻醉 使用3%戊巴比妥鈉對(duì)Sprague Dawley大鼠（300±20g）進(jìn)行腹腔注射麻醉，以麻醉程度較深為宜（用鑷子夾大鼠前后肢均無痛覺反射，呼吸由胸式轉(zhuǎn)為腹式呼吸）。若實(shí)驗(yàn)過程中大鼠麻醉程度降低，可酌量追加麻藥。

2.2 氣管插管 大鼠麻醉后仰臥，剔除頸部鼠毛，用碘酒進(jìn)行消毒，在頸部中線處剪開約1cm小切口，用玻璃分針沿肌縫做鈍性分離，分開筋膜后可見相對(duì)較大的甲狀腺，仔細(xì)游離甲狀腺與周圍組織，盡量避免損傷血管。再用血管鉗分開頸前肌群，即見白色、有環(huán)形軟骨的氣管。一手固定氣管，另一手用剪刀將氣管剪出倒T形切口，順氣管向前下方輕輕送入事先備好的與氣管直徑匹配的干凈插管，并用絲線結(jié)扎固定，防止脫落。

2.3 分離膈神經(jīng) 分離膈神經(jīng)是記錄膈神經(jīng)放電的前提，是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響實(shí)驗(yàn)的成敗，因?yàn)榇笫蟮碾跎窠?jīng)比家兔的更細(xì)，對(duì)做慣了家兔實(shí)驗(yàn)的大多同學(xué)來講，此步更是實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)。具體包含以下步驟：①動(dòng)物仰臥和分離頸前肌群：在分離膈神經(jīng)前應(yīng)盡量將大鼠仰臥，且頭偏向要分離的膈神經(jīng)的對(duì)側(cè)，這樣可在尋找、分離時(shí)充分地暴露膈神經(jīng)；用彎頭小鑷從頸外靜脈和胸鎖乳突肌之間的血管肌肉間隙向深層作鈍性分離，直至脊柱旁；②辨認(rèn)膈神經(jīng)：大鼠膈神經(jīng)主要由第Ⅳ、Ⅴ對(duì)頸神經(jīng)的腹支匯合，從斜方肌的腹緣進(jìn)入胸腔，沿心包和中膈下行支配膈肌。在頸部脊柱旁，可看見粗大、并且斜向前肢走行的白色臂叢神經(jīng)，用棉簽細(xì)心分開脊柱表面的結(jié)締組織，可觀察到從臂叢神經(jīng)發(fā)出的頭發(fā)絲粗細(xì)的膈神經(jīng)緊貼著斜方肌垂直下行（注意這里只有膈神經(jīng)是垂直往下走行的）。③剝離膈神經(jīng)：正確辨認(rèn)膈神經(jīng)后，用光滑、頭端鈍圓且彎曲的細(xì)玻璃分針，蘸少許生理鹽水，從膈神經(jīng)的外周端輕輕將神經(jīng)周圍的結(jié)締組織剝離掉（不要在神經(jīng)上來回擦動(dòng)免傷神經(jīng)），游離出約1cm的膈神經(jīng)，在其下穿黑線標(biāo)記備用。用蘸有溫?zé)嵘睇}水的棉球濕潤(rùn)神經(jīng)。④頸外靜脈插管：在分離膈神經(jīng)的對(duì)側(cè)頸部切口處，從外上到內(nèi)下小心分離皮下組織，顯露并分離頸外靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，并用血管夾夾住近心端，于頸外靜脈管壁剪一\"V\"形切口，切入深度為靜脈的1/3？郯1/2，沿此切口將備好的充滿生理鹽水的PE導(dǎo)管插入約1.5？郯2.0 cm，用線結(jié)扎固定2道。導(dǎo)管的另端連接三通管，用注射器回抽有血，注入生理鹽水無阻力、無滲漏則表明導(dǎo)管位置合適，且沒有扭轉(zhuǎn)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中大鼠需追加麻藥時(shí)可直接通過三通管進(jìn)行，若大鼠需較長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)，三通管也可連接微量注射泵，緩慢而勻速地補(bǔ)充生理鹽水，能維持大鼠以較好的狀態(tài)。⑤縫合頸部切口：膈神經(jīng)分離后將標(biāo)記好的線盤曲一團(tuán)（較顯眼），以貼近神經(jīng)處放置。手術(shù)縫合應(yīng)按解剖層次分層進(jìn)行，不要卷入或縫入其他組織。縫合的創(chuàng)緣距與針間距要均勻一致，這樣受力及分擔(dān)的張力一致并且縫合嚴(yán)密，皮膚縫合松緊度合適，既可防止后續(xù)實(shí)驗(yàn)中因縫合不嚴(yán)而致滴加的石蠟液在皮兜中滲漏，也可預(yù)防因縫合過緊影響到大鼠呼吸及膈神經(jīng)放電。⑥背側(cè)找到膈神經(jīng)：縫合后將大鼠翻轉(zhuǎn)，在頸背后進(jìn)行手術(shù)，沿膈神經(jīng)分離側(cè)斜方肌向深部鈍性分離，貼肌縫下行，找到標(biāo)記的黑線團(tuán)，小心挑起膈神經(jīng)，滴加預(yù)溫37℃的石蠟液保護(hù)膈神經(jīng)。

2.4記錄膈神經(jīng)放電 ①鉤掛膈神經(jīng)：把大鼠連同鼠板移入銅網(wǎng)屏蔽室，使用立體定位儀將大鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上（以便觀察中樞微量注射藥物對(duì)膈神經(jīng)放電的影響），利用鼠板上的立柱，穿線鉤掛，做好皮兜，充分暴露膈神經(jīng)，滴加石蠟液浸泡神經(jīng)。將鉤狀鉑銥合金雙極電極固定于三維調(diào)節(jié)器上，移動(dòng)調(diào)節(jié)器，使電極接近膈神經(jīng)，勾住膈神經(jīng)后再輕輕抬起電極。②放電記錄：打開Biopac 16導(dǎo)電生理記錄系統(tǒng)（美國(guó)），設(shè)置好電極對(duì)應(yīng)的通道（通道A1至A16分別對(duì)應(yīng)1-16個(gè)通道，采集信號(hào)可以通過硬件上的通道選項(xiàng)選擇；從MP150菜單中選擇Setup Channels，通過出現(xiàn)的Input Channels對(duì)話框設(shè)置采集信號(hào)的通道。），指定采集設(shè)置（包括：數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、采集速率、采集持續(xù)時(shí)間等參數(shù)），點(diǎn)擊START按鈕，可見膈神經(jīng)呈簇狀放電（見圖1）。使用結(jié)束后要及時(shí)保存數(shù)據(jù)，關(guān)閉電源。

3注意事項(xiàng)及實(shí)驗(yàn)體會(huì)

3.1 麻醉 嚙齒類動(dòng)物對(duì)急性缺氧的耐受性較低，對(duì)麻醉藥所致呼吸抑制作用比較敏感，麻醉過深易造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生呼吸抑制，如不能盡快完成氣管插管極易致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡；麻醉過淺則可能在插管及后面的膈神經(jīng)分離過程中造成強(qiáng)烈應(yīng)激，嚴(yán)重影響動(dòng)物的生理狀態(tài)。因此麻醉時(shí)，力爭(zhēng)一次麻倒大鼠，這就需要在老師的指導(dǎo)下認(rèn)真操作，大鼠要抓牢，進(jìn)針位置要靠大鼠下腹部，注射器針體要傾斜30°左右，進(jìn)針1cm后回抽無血、無阻塞再注射藥液，確保藥物進(jìn)入腹腔。實(shí)驗(yàn)過程中，當(dāng)麻醉程度降低時(shí)要及時(shí)追加麻藥（頸外靜脈插管補(bǔ)充麻藥），保持偏深的麻醉狀態(tài)。往往在做完手術(shù)正式引導(dǎo)膈神經(jīng)放電時(shí)，動(dòng)物開始清醒，出現(xiàn)掙扎，這時(shí)也最容易損傷膈神經(jīng)，所以應(yīng)追加麻藥，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.2氣管插管 頸部切口要正中，頸部肌肉和筋膜時(shí)要鈍性分離，盡可能找到肌縫，分開即可見到氣管，一定要避免損傷血管，引起大出血和過多組織液滲出；實(shí)驗(yàn)前要多準(zhǔn)備些粗細(xì)不等的氣管插管，根據(jù)實(shí)驗(yàn)鼠的體重范圍選擇相應(yīng)直徑的插管，插管要盡量輕柔、快速，因?yàn)椴骞鼙旧韺?duì)氣管壁就是個(gè)很強(qiáng)烈的刺激，易使氣道分泌物增多，插管內(nèi)或氣道內(nèi)黏液阻塞，引起大鼠窒息。插管過程中要緊密關(guān)注大鼠狀況，若氣道分泌物增多，應(yīng)及時(shí)用細(xì)紙條或注射器針頭清理。

3.3分離膈神經(jīng) 找準(zhǔn)并成功分離膈神經(jīng)是記錄膈神經(jīng)放電實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。尋找膈神經(jīng)時(shí)緊貼頸總動(dòng)脈分離，找到白色成束狀向前肢方向移行的臂叢，斜搭在臂叢根部的與氣管平行、狀如頭發(fā)絲且透明有彈性的神經(jīng)即為膈神經(jīng)。分離時(shí)應(yīng)把神經(jīng)周圍的結(jié)締組織分離干凈，分離過程要小心仔細(xì)，注意保護(hù)神經(jīng)，不能用金屬劃神經(jīng)，以免損傷，滴加生理鹽水，防干。勾掛膈神經(jīng)時(shí)把事先放置在膈神經(jīng)下方的手術(shù)線輕輕提起，拉動(dòng)膈神經(jīng)輕輕搭在電極上，使電極懸空，不要觸及周圍的肌肉等組織。

3.4神經(jīng)放電記錄過程中的干擾排除 干擾的來源是多方面的，首先要確定其來源是物理性的還是生物性的[3]，其次是利用引導(dǎo)電位的路徑采用摒除、隔離分析等方法尋找干擾來源，要有針對(duì)性地逐一排除。①靜電及電磁干擾的排除：靜電及電磁為常見干擾，采用屏蔽室、屏蔽網(wǎng)進(jìn)行屏蔽，對(duì)電源線路盡可能屏蔽，且所有屏蔽材料均需接地。將地線與引導(dǎo)線遠(yuǎn)離帶電流的導(dǎo)線，記錄儀器的輸入部分遠(yuǎn)離靜電場(chǎng)或電磁場(chǎng)，且儀器本身也要通過外殼接地。注意交流電50Hz的影響，屏蔽室內(nèi)不要設(shè)置帶電源的未進(jìn)行屏蔽的物體，如臺(tái)燈、日光燈、實(shí)驗(yàn)臺(tái)的保溫裝置等，確因需要，也盡量在記錄時(shí)關(guān)閉。②生物性干擾的排除：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可通過切口附近引導(dǎo)接地。盡量使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于深度麻醉，此時(shí)，動(dòng)物呼吸平穩(wěn)、肌肉松弛，要使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于良好的狀態(tài)，記錄時(shí)間長(zhǎng)時(shí)要保溫、補(bǔ)液，神經(jīng)要浸泡在預(yù)溫的石蠟油中，防止實(shí)驗(yàn)標(biāo)本逐漸干燥。膈神經(jīng)上不能有血塊、毛發(fā)等雜質(zhì)附著。

3.5 神經(jīng)放電信號(hào)的辨認(rèn) 很多同學(xué)在一開始容易把干擾信號(hào)誤當(dāng)作膈神經(jīng)放電，膈神經(jīng)放電的基本特征是：在背景放電（噪聲）的基礎(chǔ)上，成束的節(jié)律性放電，而且可觀察到電腦屏幕上的放電波形與動(dòng)物的吸氣運(yùn)動(dòng)以及監(jiān)聽器中發(fā)出的放電聲音三者同步。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙春玲，馮志強(qiáng)，陳燕，等.大鼠膈神經(jīng)和迷走神經(jīng)放電以及呼吸和心電圖同步記錄技術(shù)[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，30（2）：90-91.

[2]盧記明，張炳熙.大鼠氣管插管方法學(xué)概述[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（8）：76.

[3]李小英，羅榮敬，周樂全，等.電生理實(shí)驗(yàn)中的常見干擾及其排除方法[J].中華臨床醫(yī)學(xué)研究雜志，2005，11（14）：2096.編輯/王海靜