摘要：目的 比較三種方法對(duì)耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的陽性檢出率和特異性，尋找適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）簡易，準(zhǔn)確的方法。方法 通過頭孢西?。?0μg/片）紙片擴(kuò)散法、苯唑西林（1μg/片）紙片擴(kuò)散法和苯唑西林瓊脂篩選法對(duì)臨床分離的67株葡萄球菌進(jìn)行MRS檢測，比較其MRS檢出率，為分析NaCl對(duì)頭孢西丁和苯唑西林紙片擴(kuò)散法檢測結(jié)果的影響，同時(shí)用含4%NaCl的M-H培養(yǎng)基和普通M-H培養(yǎng)基進(jìn)行檢測，比較其差異。結(jié)果 67株葡萄球菌中瓊脂篩選法檢出率為79.1%；頭孢西丁紙片擴(kuò)散法在含4%NaCl和普通M-H培養(yǎng)基檢出率相同，均為71.6%，苯唑西林（1μg/片）紙片擴(kuò)散法在含4%NaCl的M-H培養(yǎng)基檢出率為76.1%，普通M-H培養(yǎng)基檢出率為73.1%，苯唑西林紙片法在含4%NaClM-H培養(yǎng)基上的檢出率高于普通M-H培養(yǎng)基，分別各有1株金葡和凝固酶陰性葡萄球菌未被檢出。結(jié)論 頭孢西?。?0μg/片）紙片擴(kuò)散法與苯唑西林瓊脂篩選法具有很好的相關(guān)性，且不受NaCl影響，該法操作簡便易行，各醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室均能開展，是檢測MRS值得推薦的方法。

關(guān)鍵詞：耐甲氧西林葡萄球菌；頭孢西丁紙片擴(kuò)散法；苯唑西林瓊脂篩選法；mecA基因

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1菌株 2012年3月～11月從本院檢驗(yàn)科臨床標(biāo)本分離到的葡萄球菌67株，其中金黃色葡萄球菌（SA）31株，凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）36株，保存于-20℃低溫冰箱，實(shí)驗(yàn)前轉(zhuǎn)種于5%脫纖維羊血培養(yǎng)基備用，參考菌株：ATCC25923為MRS陰性及藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株，ATCC43300為MRS陽性質(zhì)控菌株。均由云南省臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.1.2試劑和材料 藥敏紙片：頭孢西?。?0μg/片，批號(hào)：2001210）、苯唑西林（1μg/片，批號(hào)：201209），北京天壇生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)；苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品，山東瑞陽制藥有限公司生產(chǎn)；批號(hào)：12030814；M-H培養(yǎng)基，杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；批號(hào)：120422；MRS瓊脂篩選培養(yǎng)基：配制M-H瓊脂培養(yǎng)基（OXAID公司產(chǎn)品；批號(hào)：201212），加入NaCl使其濃度達(dá)4%，經(jīng)高壓滅菌，冷卻至50℃時(shí)加入苯唑西林，使其最終濃度為6μg/ml，傾注培養(yǎng)基。金葡萄菌乳膠凝集診斷試劑盒Staph Slidex-kit，法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，批號(hào)：73115。

1.2.方法

1.2.1 菌種鑒定 臨床標(biāo)本按常規(guī)進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)所有分離到的葡萄球菌用金葡萄菌乳膠凝集診斷試劑盒Staph Slidex-kit進(jìn)行鑒定。

1.2.2 菌液制備 按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，挑取孵育18～24h的單個(gè)菌落以生理鹽水稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝槐葷針?biāo)準(zhǔn)備用。

1.2.3頭孢西?。?0ug/片）紙片擴(kuò)散法：取0.5麥?zhǔn)蠁挝痪壕鶆蛲坎加诤?%NaClM-H培養(yǎng)基和普通M-H培養(yǎng)基，貼30μg/片頭孢西丁藥敏紙片35℃24h觀察結(jié)果（CNS孵育48h），SA抑菌圈直徑≤21mm，報(bào)苯唑西林耐藥，CNS抑菌圈直徑≤24mm，報(bào)苯唑西林耐藥。質(zhì)控菌株為SA ATCC 25923。

1.2.4苯唑西林紙片擴(kuò)散法 將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木壕鶆蛲坎加诤?%NaClM-H培養(yǎng)基和普通M-H培養(yǎng)基，貼1μg/片苯唑西林藥敏紙片35℃24h觀察結(jié)果（CNS孵育48h），SA抑菌圈直徑≤10mm為耐藥，SA抑菌圈直徑在11～12mm為中介，SA抑菌圈直徑≥13為敏感，CNS抑菌圈直徑≤17mm為耐藥，CNS抑菌圈直徑≥18mm為敏感。質(zhì)控菌株為SA ATCC 25923。

1.2.5 苯唑西林瓊脂篩選法 制備含6μg/ml苯唑西林、4%NaCl的篩選M-H瓊脂培養(yǎng)基，將校正過的0.5麥?zhǔn)蠁挝痪狐c(diǎn)種于上述培養(yǎng)基上，SA35℃孵育24h，CNS48h觀察結(jié)果。在此平板上只要有一個(gè)菌落生長即判斷為MRS，不生長的為甲氧西林敏感葡萄球菌（MSS）。質(zhì)控菌株為ATCC 43300。

2結(jié)果

2.1 67株葡萄球菌中乳膠凝集實(shí)驗(yàn)?zāi)?1株，定性為金黃色葡萄球菌。33株葡萄球菌中乳膠凝集實(shí)驗(yàn)陰性，定性為凝固酶陰性葡萄球菌。

2.4 三種方法對(duì)MRS的檢出結(jié)果比較 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，三種方法對(duì)MRS的檢出率具有較高的符合率，分別為頭孢西丁紙片法71.6%、苯唑西林紙片法76.1%（4%NaClM-H），73.1%（普通M-H）、瓊脂篩選法79.1%。其中頭孢西丁紙片法在4%NaClM-H和普通M-H上檢出結(jié)果相同。但幾種方法的檢測結(jié)果也存在差異，苯唑西林紙片法在含4%NaClM-H培養(yǎng)基上的檢出率高于普通M-H培養(yǎng)基，分別各有1株金葡和凝固酶陰性葡萄球菌未被檢出，此外，在普通M-H培養(yǎng)基上有一例SA抑菌圈直徑處于藥敏判斷中介，無法判斷是否為MRSA。頭孢西丁紙片法比苯唑西林瓊脂篩選法少檢出5株MRS，在含4%NaClM-H培養(yǎng)基上，頭孢西丁紙片法比苯唑西林紙片法少檢出5株MRS，在普通M-H培養(yǎng)基上比苯唑西林紙片法少檢出3株MRS。

3 討論

葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)理[1]主要有以下幾個(gè)方面：①由染色體mecA基因大量表達(dá)一種特殊青酶素結(jié)合蛋白（PBP2a），這種蛋白存在細(xì)胞表面，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有極低的親和力，使MRSA很少或不能與β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥。②產(chǎn)生大量β-內(nèi)酰胺酶，緩慢水解β-內(nèi)酰胺抗生素。③細(xì)菌產(chǎn)生PBP2a之外的其它過量PBPs。MRSA產(chǎn)生的最主要原因?yàn)楫a(chǎn)生mecA編碼的PBP2a，不利于mecA基因表達(dá)的外界條件可使傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性[2]，從所做實(shí)驗(yàn)看來，在M-H培養(yǎng)基中加入4%NaCl，孵育溫度35℃，結(jié)果頭孢西丁紙片法陽性的48株葡萄球菌在瓊脂篩選法上均顯示耐藥，苯唑西林紙片擴(kuò)散法陽性的51株葡萄球菌在瓊脂篩選法上也顯示耐藥，并且苯唑西林紙片擴(kuò)散法在加4%NaClM-H培養(yǎng)基比普通M-H培養(yǎng)基多檢出2例MRSA，還未出現(xiàn)普通M-H培養(yǎng)基SA抑菌圈處于中度敏感，無法判斷結(jié)果的情況（普通M-H培養(yǎng)其中有1例SA抑菌圈直徑處于中度敏感）。提示上述條件有利于mecA基因表達(dá)，克服葡萄球菌生長不均一的耐藥特點(diǎn)，從而提高表型檢測的敏感性。耐藥的不均一性也是表型檢測造成假陰性的因素[2]。葡萄球菌的耐甲氧西林不均一性和mecA基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子mecR1、mecI等有關(guān)。觀察K-B擴(kuò)散法時(shí)應(yīng)注意抑菌圈內(nèi)是否有單個(gè)菌落或霧狀生長，凡抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)散在菌落者均視為MRS菌株。就我們所做實(shí)驗(yàn)的觀察而言，加4%NaClM-H培養(yǎng)基藥敏實(shí)驗(yàn)抑菌環(huán)明顯小于不含鹽者，易于觀察測量抑菌圈直徑，若不仔細(xì)觀察普通培養(yǎng)基易發(fā)生假陰性結(jié)果。

mecA基因檢測被視為對(duì)MRS檢測的一種\"金標(biāo)準(zhǔn)\"，但受設(shè)備、儀器試劑、人員素質(zhì)和費(fèi)用的限制，不易在各醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室普遍開展。本文根據(jù)NCCLS2013年1月用30ug/片頭孢西丁檢測mecA介導(dǎo)苯唑西林耐藥金黃色葡萄球菌，用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法對(duì)67株葡萄球菌與以前推薦常規(guī)表型檢測法進(jìn)行比較評(píng)價(jià)，結(jié)果頭孢西丁紙片擴(kuò)散法陽性的48株葡萄球菌在苯唑西林瓊脂篩選法上均顯示耐藥，符合率為91%（48/53），說明頭孢西丁紙片擴(kuò)散法與苯唑西林瓊脂篩選有很好的相關(guān)性，并且頭孢西丁紙片擴(kuò)散法藥敏實(shí)驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)不存在中介結(jié)果，克服了苯唑西林紙片擴(kuò)散法檢測中，葡萄球菌抑菌圈為中介需做苯唑西林MIC來判斷的問題，且該法操作簡便，設(shè)備簡單，各級(jí)醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室均能開展，是檢測MRS值得推薦的方法。

本文苯唑西林瓊脂篩選法比頭孢西丁紙片擴(kuò)散法多檢出5株MRSA，因受條件所限，本次實(shí)驗(yàn)無法運(yùn)用PCR檢測mecA，所以無法判斷這5株葡萄球菌mecA的存在與否，但根據(jù)NCCLS推薦頭孢西丁檢測MRSA的原因：\"用30ug/片頭孢西丁檢測對(duì)葡萄球菌做藥敏實(shí)驗(yàn)?zāi)茴A(yù)報(bào)mecA介導(dǎo)的MRSA耐藥[3]\"，且參考相關(guān)論文頭孢西丁紙片擴(kuò)散法與多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測耐甲氧西林葡萄球菌的mecA符合率為100%，所以推測這5株葡萄球菌可能為mecA陰性，其耐藥原因可能為β-內(nèi)酰胺酶的大量產(chǎn)生，或存在PBP2a之外的低親和力PBP有關(guān)，這5株葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素或β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺類酶的聯(lián)合抑制劑仍然敏感，預(yù)示可選用毒副作用比萬古霉素低的其它抗生素。這正是NCCLS推出頭孢西丁檢測MRSA的理由：頭孢西丁代替苯唑西林檢測mecA介導(dǎo)的MRSA，可提高M(jìn)RS檢測的特異性。從而減少了非mecA基因介導(dǎo)的假M(fèi)RSA，臨床醫(yī)生對(duì)這類感染的治療也更有針對(duì)性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鄭波，李家泰.多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測耐甲氧西林葡萄球菌[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1999；22（3）：145.

[2] 洪秀華，唐毅，毛向群，等.耐甲氧西林葡萄球菌四種方法比較及臨床應(yīng)用[J].上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1999，14（4）203.

[3] 陳民均.美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)2004年版有關(guān)藥敏實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化更新要點(diǎn)[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2004；27（3）：608.編輯/王海靜